干热法灭活对新型冠状病毒肺炎相关炎症指标检测的影响

赵明海，李 欣，魏 东，罗 敏，张雅洁，杨懿祺，郑 磊

（南方医科大学南方医院检验科，广东 广州 510515）

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）已对我国及全世界人民的健康造成了巨大的威胁[1-3]。我国已将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并按照甲类传染病管理。SARSCoV-2的主要传播途径是经呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播（手-口、粪-口），同时可能存在气溶胶传播[4]。目前，对于COVID-19的诊断、病情评估及监测主要根据各项实验室检测指标，其中检测过程中的拔盖步骤存在气溶胶传播的高风险[5]。拔盖前对病毒灭活可有效降低其传播风险，保护检验人员的安全。目前认为56 ℃ 30 min可对SARS-CoV-2进行灭活，已有报道56 ℃ 30 min灭活处理血液样本对免疫层析法及化学发光免疫分析法SARS-CoV-2抗体检测、咽拭子SARS-CoV-2核酸检测结果无明显影响[6-7]。由于COVID-19诊疗过程中涉及的实验室检查不仅包括核酸检测、抗体检测，其他实验室指标也十分重要，其中炎症标志物不仅对COVID-19的鉴别诊断意义重大，对COVID-19重症患者的病情评估及用药指导也十分重要。白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）可以作为判断疾病严重程度和预后的生物标志物[8]，C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和降钙素原（procalcitonin，PCT）可以作为鉴别诊断细菌、病毒感染的辅助指标[9-11]。白露等[12]发现炎症细胞因子刺激和释放治疗会使相关指标水平升高，56 ℃ 30 min水浴法灭活对CRP和PCT的检测结果无影响，对IL-6的检测结果有影响。但该研究样本量较小，且样本采集是使用带分离胶的试管，并从离心后的样本中分离出1/2血清作为灭活后检测的样本，而临床大部分实验室是使用样本采集管而非带分离胶的试管，灭活是在样本拔盖前进行，凝集后红细胞及分离血清在同一试管内。本研究扩大了样本量，并通过模拟临床实际进行灭活前处理，即收集临床中已进行过CRP、PCT和IL-6检测的样本，盖上帽盖后立即进行灭活并再次检测，进一步明确干热法灭活对COVID-19诊疗常用炎症指标的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

随机选取2020年3月2日—5月28日南方医科大学南方医院检验科进行过CRP、PCT和IL-6检测，且结果尽量覆盖线性范围的无脂血、溶血的临床剩余血样本332例，其中CRP检测样本104例、PCT检测样本124例、IL-6检测样本104例。采集静脉血后，2 191×g离心10 min，收集分离的血清进行检测。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会审查通过（伦理号：NFEC-2018-144）。

1.2 仪器与试剂

静脉血样本采集管购自成都瑞奇科技实业有限责任公司。IL-6和PCT采用cobas e602全自动电化学法发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光双抗体夹心法）检测，CPR采用cobas e7500全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（颗粒增强投射免疫比浊法）检测。干热灭活仪器为DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 方法

在当天室内质控合格的前提下，收集当天符合纳入要求、已检测CRP、PCT和IL-6且经过审核的剩余血样本，盖上帽盖后放入干燥箱进行56 ℃ 30 min干热灭活，使用经校准的温度计分别在灭活前、后对干燥箱温度进行监测。灭活后将帽盖拔去，当天重新对样本进行CRP、PCT和IL-6检测，并记录结果。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 23.0软件进行统计分析，采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 8软件进行绘图。非正态分布的计量资料采用中位数（M）[四分位数（P25，P75）]表示，组间比较采用配对秩和检验。采用Spearman相关分析评估灭活前、后检测结果的相关性，采用Bland-Altman法进行一致性分析，以≥95%的散点位于差值的95%可信区间内为有一致性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干热法灭活对CRP、PCT及IL-6检测结果的影响

与灭活前比较，332例样本灭活后均未出现肉眼可见的溶血现象。CRP灭活前、后检测结果差异无统计学意义（P=0.456），PCT、IL-6灭活前、后检测结果差异有统计学意义（P＜0.001）；PCT经灭活后有98例样本水平下降，其中5例超过参考区间的样本灭活后检测结果降至参考区间内（灭活前分别为0.050、0.053、0.056、0.058 及0.600 ng/mL，灭活后分别为0.040、0.046、0.049、0.047及0.042 ng/mL），1例处于医学决定水平附近（0.5 ng/mL）的样本经灭活后低于医学决定水平（由0.503 ng/mL降为0.478 ng/mL）。见表1、图1。

表1 灭活前、后3项炎症指标检测结果比较

图1 灭活前、后散点图

2.2 灭活前、后检测结果的一致性和相关性

Bland-Altman图分析结果显示，PCT、CRP及IL-6分别有96.77%、97.11%及97.11%的散点位于差值的95%可信区间内，干热法灭活前、后检测结果结果具有一致性（相对偏移分别为0.431%、0.141%、2.133%），见图2。灭活前、后PCT、CRP、和IL-6的检测结果均呈正相关（r值分别为0.992、0.999、0.966，P＜0.05）。

图2 热灭活前、后一致性分析

3 讨论

由SARS-CoV-2引起的疫情严重威胁着全世界人民的生命安全，尽管明确的接触史、全身症状和肺炎的影像学改变可基本确定COVID-19，但实验室检测结果仍是COVID-19确诊的金标准。由于SARS-CoV-2具有极强的传染性，检验人员在处理各种样本时面临极大的感染风险。如何减少检验工作人员的感染风险，保证实验室生物安全，引起了临床实验室的关注。目前认为SARS-CoV-2的传播途径除经呼吸道飞沫传播、接触传播外，还可能存在气溶胶传播，特别是在相对封闭的实验室中长时间暴露于高浓度气溶胶时，感染风险有可能增加[14]。尽管《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》[15]要求未经灭活的COVID-19患者相关临床样本的血清学检测应在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护，但也不能完全保证检验人员的安全。

目前，学者们认为SARS-CoV-2对紫外线和热敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可对其有效灭活[4]。因此，在样本开盖之前对其进行灭活可有效减少检验工作人员操作风险。本研究结果显示，56 ℃ 30 min灭活后，261例样本并未出现肉眼可见的溶血现象，灭活对CRP的检测结果无影响，对PCT、IL-6有影响，与刘兆宇等[13]报道的加热灭活对PCT检测结果无影响的结论不一致。本研究124例PCT样本经灭活处理后，有98例水平下降，其中5例超过参考区间的样本灭活后检测结果降至参考区间内。有研究结果表明，在样本采集24 h后，PCT水平在室温下大约下降12%，4 ℃条件下大约下降6%[16]。由此可见，加热灭活可能会加快PCT水平的下降。此外，PCT、IL-6、CRP灭活前、后检测结果的一致性及相关性显著。因此，临床上可考虑使用不带分离胶的常规采血管对CRP进行灭活处理，但对PCT及IL-6进行灭活需慎重。值得注意的是，由于PCT灭活后结果存在下降趋势，对于处于参考区间临界值及医学决定水平附近的结果需要谨慎处理。

相较已有的研究报道，本研究从临床更为常见的情境出发，包括使用临床上多采用的不带分离胶的采血管，离心后凝集的红细胞和血清在同一试管内等情况，对COVID-19诊疗中用于检测3项炎症指标的样本进行灭活处理，评估其操作可行性。本研究也存在一些局限性：（1）本研究只是提供策略参考，受不同仪器及检测原理的影响，不同实验室需根据自身条件评估灭活对检测结果的影响；（2）大多临床实验室CRP与血常规合并使用乙二胺四乙酸抗凝管、全血模式检测，尤其在发热门诊，但由于本实验室尚未开展此类检测，因此该类样本灭活方式及检测结果一致性需进一步验证。

本研究通过模拟临床常见灭活前处理流程，发现56 ℃ 30 min干热灭活对CRP检测结果无影响，对PCT、IL-6检测结果有影响。本研究结果可为拟通过加热灭活减少实验室SARS-CoV-2检测样本传染性风险的前处理流程提供可行性参考，在防护物资有限的情况下，干热法灭活可有效降低感染风险，保证检测人员安全。