不同调控措施对连作高粱生长及根际土壤微生物群落结构的影响

樊芳芳，白文斌，王 磊，王劲松，聂萌恩，刘 鹏，李 光，范昕琦

(1.山西农业大学 高粱研究所，山西 晋中 030600；2.山西农业大学 农业环境与资源研究所，山西 太原 030031)

连作可导致作物产量降低、土传病害严重、植物病原体富集[1]，而合理轮作可有效缓解连作障碍[2-3]。已有研究表明，连作会导致高粱长势及产量降低[4-6]。作为酿造业的主要原料，高粱主要种植在贵州、山西等省区。近年来，由于订单农业的需要，酿造企业为追求高收益，连续多年种植高粱，导致出现高粱连作障碍。因此，缓解或者克服连作障碍，成为高粱栽培可持续发展的一项重要工作。

微生物是土壤生态系统中最重要和活跃的部分，在促进土壤养分循环、维持系统稳定性以及可持续利用中占主导地位[7]。健康的土壤微生物群落可表征土壤健康高产、抑制土传病害[8]。以植物根际为核心，植物-土壤-微生物及其他环境条件相互作用形成根际微生态环境，有学者认为，根际微生态系统的失衡是造成连作障碍的主要原因[9-10]。HUANG等[11]认为，植物-土壤的相互反馈调节成为现代可持续发展农业的重要领域。因此研究根际土壤微生物的变化规律，对解决高粱连作障碍具有重要意义。

对玉米[12]、大豆[13-14]、马铃薯[15-16]等作物的研究表明，采取合理的轮作制度或增施有益菌均可有效缓解连作障碍。刘杭[12]用Biolog-Eco技术对3种典型旱地作物连作研究表明，大豆和小麦长期连作条件下，土壤微生物对糖类碳源的利用率显著低于轮作；玉米长期连作条件下，土壤微生物对多聚物、胺类碳源的利用率显著低于轮作。不同栽培制度可改变连作马铃薯根际土壤微生物群落结构代谢多样性及遗传多样性[15-17]。土壤微生物群落结构变化特征因作物品种和试验条件仍有所差异。迄今为止，没有针对高粱连作根际土壤微生物群落代谢多样性与遗传多样性及不同调控措施的系统研究。鉴于此,采用高粱盆栽栽培试验，通过Biolog-Eco板和DGGE(变形梯度凝胶电泳)技术，对不同调控措施下高粱根际土壤的功能代谢多样性及基因多样性进行分析。探究有效调控高粱连作障碍的措施，以期为缓解和克服高粱连作障碍提供理论依据与数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验设计

盆栽用土采集于山西省农业科学院东阳试验基地，连作土壤采自于高粱连作试验田，轮作土壤采自于高粱/玉米轮作田的玉米茬，除去人为扰动0～2 cm表层土后，采集2～20 cm的根层土壤，多点采样并混匀，采集土壤化学特征为：pH值8.40、有机质含量14.16 g/kg、全氮含量0.98 g/kg、速效磷含量8.17 mg/kg、速效钾含量259.82 mg/kg。供试高粱品种为山西省农业科学院高粱研究所选育的矮秆品种晋杂34。供试土壤生态调理剂为山西省农业科学院农业环境与资源研究所筛选的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacienssp.)Pb-4发酵液。盆栽试验于2017年4—7月在山西省农业科学院联栋温室内进行；设置3个处理：T1(高粱连作)、T2(高粱连作施加生态调理剂)、T3(高粱/玉米轮作)，每个处理重复6次。

1.2 试验方法与根际土采集

在装盆前将称好的肥料与不同处理土壤充分混匀(施N 0.2 g/kg、P 0.15 g/kg、K 0.15 g/kg)，每盆5 kg(盆高18 cm、内径21 cm)，播种前将高粱种子催芽，每盆播20粒，留苗4株到抽穗期。在出苗60 d破坏性取样，根据抖根法[17]采集高粱根际土壤，去除杂质后立即保存于-80 ℃备用。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 高粱生长特征测定 在盆栽出苗60 d时破坏性采样，测定作物株高、茎粗，烘干后测其干物质量。

1.3.2 土壤微生物群落功能多样性测定 土壤微生物群落功能多样性使用Biolog-Eco板测定(Biolog Inc,CA,USA)。称取相当于10 g烘干土质量的新鲜土样加到已灭菌的生理盐水(NaCl溶液，0.85%)中，200 r/min旋涡振荡30 min，静置10 min后用生理盐水稀释到10-3，将稀释液加入Biolog-Eco板中，每孔加入150 μL，标记后置于28 ℃的培养箱中连续培养168 h，每隔24 h用Biolog自动读数仪测定吸光值(OD590)[3]。计算每孔颜色变化率(AWCD)、McIntosh指数(McIntosh index)、香农(Shannon)指数、均匀度指数(Pielou index)[18]。AWCD值来表征根际土壤微生物代谢群落，计算公式如下：

式中，Ci为微孔板第i孔的吸光值，R为对照孔的吸光值，31为微孔板有碳源孔的总数。

根据官能团的不同，将Biolog-Eco板中31种碳源分为6大类，胺类、氨基酸类、糖类、羧酸类、双亲化合物类、聚合物类。选择AWCD曲线的拐点处，对培养96 h的数据进行不同碳源代谢能力、多样性指数分析[18]，计算公式如下：

香农指数=-∑pilnpi

均匀度指数=Shannon指数/lnS

1.3.3 土壤微生物基因组DNA的提取及DGGE分析 土壤总DNA的提取参照土壤DNA提取试剂盒(生工生物工程股份有限公司)进行。以样品总DNA为模板，细菌采用16S rDNA引物对GC-338F(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG

CACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/R518(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，真菌采用18S rDNA引物对GC-Fung(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCG-TTACCCGTTG-3′)/NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)，为了使PCR产物在DGGE胶上更好地分离，在前引物5′末端加了含有40 bp的GC夹子。PCR采用30 μL反应体系：2×PCR Master 12.5 μL(生工生物工程股份有限公司)，DNA模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，灭菌的双蒸水补足至30 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，48 ℃退火50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。热盖设置温度105 ℃。所有PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

采用Bio-Rad公司的DcodTM的基因突变检测系统(Dcod univeral detection system instrument)对PCR反应产物进行分离。聚丙烯酰胺含量为8%(w/v)，细菌的DGGE变性含量为35%～65%，真菌的DGGE变性含量为18%～38%，电泳在1×TAE缓冲液中，65 V电压，60 ℃条件下电泳300 min，电泳后用4S核酸燃料泡染40 min，洗净后用凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)拍照。采用Quantity one软件分析DGGE图谱条带特征，计算多样性指数[19]。

1.4 数据处理

使用Excel 2007整理数据，使用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对高粱生长的影响

T2、T3处理高粱的茎粗、生物量均显著高于T1处理，T2处理高粱的株高显著高于T1和T3处理(表1)。与T1处理相比，T2处理高粱的株高、茎粗和干物质量分别增加16.95%、13.33%和19.82%，差异均显著；T3处理高粱的茎粗、干物质量分别增加12.00%、16.22%。这表明不同调控措施(施加调理剂、轮作)均可促进高粱生长，有效缓解高粱连作障碍问题，高粱连作施加生态调理剂(T2处理)促进效果更好。

表1 不同处理对高粱生长的影响

2.2 不同处理对高粱根际土壤微生物群落功能多样性的影响

2.2.1 不同处理对高粱根际土壤微生物群落代谢活性的影响 AWCD值可反映土壤微生物群落的碳源代谢活性。由图1可知，随培养时间延长，高粱根际土壤AWCD值不断升高，培养168 h时增加相对缓慢。不同处理比较，T3处理高粱根际土壤微生物群落AWCD值高于T1、T2处理，培养96 h后差异均达显著水平(P<0.05)，培养96 h时，T3处理高粱根际土壤微生物群落AWCD值比T1、T2处理分别高出16.72%、19.15%(P<0.05)。可见，与玉米轮作显著提高了高粱根际微生物群落碳源代谢活性，而施加生态调理剂对高粱根际微生物群落代谢活性影响不显著。

图1 不同处理AWCD值随培养时间的变化

由表2可知，对培养96 h后不同处理根际土壤微生物群落不同碳源利用能力的分析发现：与T1处理相比，T3处理根际土壤微生物群落对氨基酸类、糖类、双亲化合物类碳源的利用能力显著增加(P<0.05)，对这3类碳源的利用能力分别是T1处理的1.85倍、1.63倍、1.78倍。与T1处理相比，T2处理高粱根际微生物群落对胺类的利用能力增加(P<0.05)，其利用能力分别是T1、T3处理的5.5倍、1.38倍。

表2 不同处理对高粱根际土壤微生物群落不同碳源利用能力的影响

2.2.2 不同处理高粱根际土壤微生物群落功能多样性及主成分分析 T3处理根际土壤微生物群落的McIntosh指数和均匀度指数较T1处理均显著增加，T2处理高粱根际土壤微生物群落的均匀度指数较T1处理显著增加(表3)。T3处理的McIntosh指数分别比T1、T2处理增加31.41%、32.37%；T2、T3处理的均匀度指数分别比T1处理增加17.48%、19.42%(P<0.05)。

表3 不同处理高粱根际土壤微生物群落功能多样性指数

不同处理在主成分图上有明显分异(图2)，T3处理在主成分1(PC1)上得分最高，而T1处理得分最低，位于PC1负轴方向。T2处理在主成分2(PC2)上得分最低，位于PC2负轴方向，而T1、T3处理在PC2上无显著分异。这表明PC1对T1和T3处理间分异的贡献较大，PC2对T2处理与其他处理间分异的贡献较大。对PC1显著相关的碳源有：氨基酸类3种(L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸)、糖类2种(β-甲基D-葡萄糖苷、N-乙酰基-D-葡萄胺)、羧酸类2种(D-半乳糖酸γ内酯、D-半乳糖醛酸)、双亲化合物2种(丙酮酸甲酯、葡萄糖-1-磷酸盐)、聚合物类3种(吐温40、吐温80、α-环状糊精)，对PC2显著相关的碳源有羧酸类2种(衣康酸、D-苹果酸)(表4)。T1、T3处理的分异主要由于与PC1显著相关的12种碳源综合代谢差异导致的，而T2处理与T1、T3处理的差异主要是由于与PC2显著相关的衣康酸和D-苹果酸的代谢差异导致的。

图2 高粱根际土壤微生物群落代谢主成分分析

表4 PC1、PC2显著相关碳源

2.3 不同处理高粱根际土壤微生物群落DGGE分析

2.3.1 细菌DGGE图谱及基因香农指数 所得16S rDNA片段通过DGGE分离，可以看出不同处理DGGE条带数量及亮度有差异(图3)。细菌DGGE电泳分离条带较多，这表明高粱根际土壤细菌种群数量丰富，不同处理条带A1上的亮度差别明显，T3处理A1条带浓度较低，在电泳胶的A2区域，T3处理的条带数量多于T1和T2处理。这说明，与不同调控措施相比，T1处理高粱根际土壤细菌基因香农指数显著降低，比T2、T3处理分别降低36.54%、46.49%(表5)。

图3 细菌群落的DGGE图谱

表5 细菌与真菌基因香农指数

2.3.2 真菌DGGE图谱及基因香农指数 所得18S rDNA片段通过DGGE分离(图4)，不同处理根际土壤中真菌18S在条带数量上有明显差别，T1、T2处理都出现特异性条带，这表明高粱连作导致根际微生物群落中出现特有真菌。T1处理高粱根际土壤中真菌18S区的基因香农指数较高(表5)，T1与T2处理高粱根际真菌基因香农指数显著高于T3处理，其中T1处理高粱根际的真菌基因香农指数比T3处理高出14.47%。

图4 真菌群落的DGGE图谱

2.4 Person相关系数分析

高粱茎粗、株高与干物质量均呈极显著正相关(表6)；根际土壤微生物群落的功能多样性指数与细菌基因多样性指数显著正相关，而与真菌基因多样性指数显著负相关，这说明细菌与真菌的多样性的变化导致根际土壤微生物群落结构失衡，进而影响了根际土壤微生物群落的代谢多样性。

表6 Person相关系数分析

3 结论与讨论

同一作物或近缘作物连作后，在正常的管理条件下，也会出现连作障碍现象，如生长情况变差、产量降低、品质变劣等，合理有效的农艺措施如轮作[5,12]、施用土壤生态调理剂[20-21]或者土壤消毒[22-24]可以促进作物生长，有效缓解连作障碍现象。本研究也表明，与连作高粱相比，轮作及施加生态调理剂均增加了高粱株高、茎粗和干物质量，促进高粱生长，缓解高粱连作障碍。

Biolog-Eco板通过检测土壤微生物群落对31种单一碳源的利用能力，测定土壤微生物群落代谢活性及代谢多样性。AWCD值表示对31种碳源的平均利用能力，其值越高表示土壤微生物群落代谢活性越高。本研究发现，T1处理高粱根际土壤微生物群落的AWCD值低于T3处理，说明连作高粱根际土壤微生物群落代谢活性减弱；高粱连作后施加生态调理剂(T2处理)增加了高粱根际土壤微生物群落对胺类的代谢活性，高粱/玉米轮作(T3处理)增加了高粱根际土壤微生物对氨基酸类、糖类、双亲化合物类碳源的利用能力，这与本课题组之前大田高粱连作障碍研究结果一致[3,5]，轮作后高粱根际土壤微生态环境得到优化，微生物群落对多种碳源的代谢明显升高，刘杭[12]也得出一致结论，轮作后土壤微生物群落对多种碳源代谢的利用能力增强，代谢多样性增加。通过DGGE条带分析可知，与T3处理相比，T1、T2处理高粱根际土壤中细菌香农指数降低，真菌香农指数显著增加，这可能是由于高粱连作后根际土壤中真菌类微生物的累积，打破了原来土壤中的微生态平衡，根际土壤由细菌型向真菌型转变，根际土壤微生物群落代谢活性降低，尤其减少了对氨基酸类、糖类及双亲化合物类碳源的利用，根际土壤微生态环境恶化，发生高粱连作障碍。孟品品等[17]通过对连作马铃薯根际土壤微生物群落的PCR-DGGE分析，也证实了连作会增加土壤中真菌类病原菌镰刀菌，进而影响马铃薯块茎产量降低。

综上所述，连作后高粱长势减弱，根际土壤微生态平衡被破坏，与连作高粱相比，施加生态调理剂或者与玉米轮作都可促进高粱的生长，改变连作高粱根际土壤微生物群落的代谢功能及遗传多样性，缓解连作障碍。本研究采用Biolog-Eco和DGGE技术探讨不同调控措施对高粱根际土壤微生物群落结构的影响，从碳源代谢功能变化、细菌与真菌基因群落变化的角度进行解析，下一步仍需借助分子生物学方法明确具体关键微生物菌群的变化，并进一步探究生态调理剂缓解连作障碍的作用机制。