益心泰对慢性心力衰竭大鼠心室重构及p-p38MAPK、β-arrestin 蛋白表达的影响

孙 涛，李 雅*，郭志华，，龙 云，曾 英，王 月

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

随着多数心血管疾病得到良好的诊治，慢性心力衰竭(chronic heart failure， CHF)所带来的问题越来越突出，现已成为人类健康道路上最大的敌人之一，绝大多数心血管疾病发展到终末期都会并发心力衰竭。 研究表明，心室重构在心力衰竭发生和发展的过程中扮演重要角色[1]。 而β-arrestin 的偏向激活作用在心室重构中的发挥也得到了越来越多的关注。 近期研究证实，成功抑制β-arrestin 介导的p38MAPK 信号通路对心肌有保护作用[2]。 中药复方益心泰长期应用于慢性心力衰竭患者的临床治疗，且疗效已得到充分肯定[3-6]。本课题组前期研究已经证明，益心泰能够通过抑制G 蛋白偶联受体，延缓心力衰竭[7]，但是否能够抑制β-arrestin 介导的p38MAPK 信号通路尚不清楚。本研究通过观察益心泰对慢性心力衰竭大鼠心室重构时β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达的影响，试图阐明益心泰抗心室重构的多重作用机制，为将其应用于临床提供充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD 大鼠60 只，雄性，清洁级，体质量200～230 g，由湖南省人民医院动物中心提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 药物、试剂与仪器设备：

益心泰由湖南中医药大学第一附属医院中成药制剂中心提供的医院制剂，主要由黄芪、红花、猪苓等组成；卡维地洛由山东齐鲁制药有限公司提供(批号：201800035)，商品名：金络，10 mg/片；β-arrestin蛋白表达试剂盒（湖南玉堂生物试剂公司）；兔抗鼠p38MAPK 抗体(北京博奥森公司)；AEV-210 电子分析天平(长沙湘仪天平仪器厂)；Vivid 7.0 彩色超声仪（美国GE 公司）；UV-365 型紫外分光光度计(日本岛津)。

1.3 模型制备与动物分组

60 只清洁级SD 雄性大鼠中，随机数字表法选取10 只设正常对照组，其余50 只采用腹腔注射盐酸阿霉素法建立心衰大鼠模型[8]，按第1 次和第2次1.0 mg/（kg·d）剂量给药，第3 次和第4 次2.0 mg/（kg·d）剂量给药，第5 次和第6 次1.0 mg/（kg·d）剂量给药，第7 次和第8 次2.0 mg/（kg·d）剂量给药，累积剂量12 mg/kg，隔天注射，共计15 d，观察大鼠表征及行为改变。 于第16 天完成心脏彩超检查，以左室射血分数(LVEF)为参考指标，数值低于40%作为心力衰竭模型成功的标志，同时大鼠出现体质量减轻、活动减少、精神萎靡、毛色黯淡无光泽，列入观察对象。在符合上述标准的大鼠中，随机选取30 只，再随机分为3 组：益心泰组2.0 g/（10 mL·kg)；卡维地洛组10 mg/（10 mL·kg)；正常对照组及模型组(生理盐水等容积)，各组均为每日给药1 次，连续灌胃给药8 周，观察整个实验过程中大鼠一般情况。给药8周后，检测大鼠心室重构指标及β-arrestin、p-p38MAPK蛋白表达情况。

1.4 各项指标的测定

1.4.1 左室结构观测 采用Vivid 7.0 彩色超声仪进行检测。 分别取胸骨旁左室长轴切面和心尖两腔心切面，由二维超声引导M 型曲线并进行测量。 测量指标为左心室后壁厚度（posterior Wall thicknessin diastole， PWD）、室间隔厚度(interventricular septal thickness at end diastole， IVSD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左心室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic dimension， LVESD)，均 记 录 连 续3 个 心 动 周 期 数值，再取平均值。

1.4.2 心室重构指标检测 左心室重量指数(left ventricular weight index， LVWI) 和右心室重量指数(right ventricular weight index， RVWI)，左心室湿重/体重即左心室重量指数；右心室湿重/体重即右心室重量指数[9]。

1.4.3 Western blot 检测β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达 采用Western blot 检测β-arrestin、p-p38MAPK蛋白的相对表达，洗膜后用GE AI600 多功能成像仪扫描条带，并用Gel-Pro Analyzer 4.0 软件对结果进行分析比对。

1.5 统计学方法

运用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，检验均采用双侧检验，P＜0.05 即认为检验的差异具有统计学意义。结果以“±s”表示，先行正态检验和方差齐性检验，若满足正态性及方差齐性，行单因素方差分析；若不满足采用非参数检验。

2 结果

2.1 左室结构变化情况比较

与正常对照组比较，模型组左室后壁、室间隔厚度明显降低，左心室舒张末期内径及收缩末期内径均明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组进行比较，益心泰组、卡维地洛组左室后壁、室间隔厚度增加，左心室舒张末期内径及收缩末期内径减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)；益心泰组与卡维地洛组各项指标组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图1 和图2。

图1 各组室间隔及左室后壁厚度变化情况

图2 各组左室舒张末内径及收缩末内径变化情况

2.2 心室重构指标变化情况

与正常对照组比较，模型组左、右心室重量指数明显增大，差异具有统计学意义(P＜0.01)。 与模型组比较，益心泰组、卡维地洛组左、右心室重量指数均降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，益心泰组与卡维地洛组各项指标组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图3。

图3 各组左右心室质量指数变化情况

2.3 β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达情况

与正常对照组比较，模型组β-arrestin 蛋白表达明显下降，p-p38MAPK 蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，益心泰组、卡维地洛组β-arrestin 蛋白表达增加，p-p38MAPK蛋白表达减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)；益心泰组与卡维地洛组各项指标组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 结果见图4。

图4 各组β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达情况

3 讨论

前期研究表明，β-arrestin 蛋白家族属于一种脚手架蛋白，多种信号蛋白可以被它募集，根据募集蛋白的不同，β-arrestin 会调节7 次跨膜受体，产生不同的效应，如去磷酸化、泛素化、反式激活等[10]。随着研究的深入，β-arrestin 越来越多的作用被发现，它作为脚手架蛋白的同时也是一类信号分子，且不依赖于G 蛋白；β-arrestin 亦属于接头蛋白，可以与体内多种激酶与目标蛋白相互作用；β-arrestin 能够激活表皮生长因子，并在此过程中发挥关键作用[2]。 由于其作用靶点多样，功能丰富，已经成为药物研发的新目标。 同时，p38MAPK 作为β-arrestin 的下游重要靶点，也受到越来越多的关注。 p38MAPK 广泛分布于人体细胞内，且可被多种因素激活，例如辐射、炎症、缺氧、细胞因子等[11-12]。 p38MAPK 的激活与心力衰竭的发生有着明确关系，研究已证明p38MAPK磷酸化后诱发心力衰竭的主要机制是启动心肌细胞凋亡，进而诱发心室重构[13-15]。 本研究已经证明益心泰和卡维地洛对大鼠心室重构有显著的抑制作用，如图1、2 所示两治疗组均改善了左室结构，降低了左、右心室重量指数。 从图3 可知，益心泰组和卡维地洛组β-arrestin 蛋白表达增加，p-p38MAPK 蛋白表达减少，与模型组及正常对照组比较，差异均具有统计学意义。 综上结果可知，益心泰抑制心室重构作用显著，其作用机制可能是通过调节心肌细胞内的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达实现的。

心力衰竭临床上以呼吸困难、水肿、乏力等症状为主要表现，在中医学中属“喘证”“水肿”“虚证”等范畴。 其共同病机为“本虚标实”，又以气虚为主，气虚则血虚，气虚则血瘀，气虚则水停。 益心泰是遵从上述理论指导，结合导师多年临床经验总结而成的中药复方，由黄芪、红花、猪苓等药物组成，该复方主要针对的病机是气虚血瘀水停。方中黄芪用量最重，为君药，可补气之不足；红花为臣药，活血化瘀，因其入心经，在本方中兼作使药；猪苓为佐药，利水消肿，配合余药，共奏益气活血利水之功。

综上所述，本研究表明益心泰有效调节心肌细胞内的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表达，从而明显抑制心室重构。但β-arrestin 介导的p38MAPK 信号通路作用机制具有多样性，且步骤非常复杂，仍需进一步深入研究。