基于艾灸温通理论探讨艾灸内关穴预处理对大鼠MIRI 保护机制的研究

黄 河，王 晶，方 园，刘 密，2，常小荣*，冯 芳*

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙410208；2.浏阳市中医医院，湖南 浏阳410300；3.郴州市第一人民医院西院，湖南 郴州423000）

冠心病是临床高死亡率疾病之一，临床多采用药物、介入、外科手术等来改善冠状动脉血供、降低心肌耗氧量，但各种血运重建手段在恢复心肌供血供氧时可同时导致心肌细胞损伤甚至坏死，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)，导师常小荣教授在课题组多年灸法研究的基础上，提出艾灸的温热刺激具有温通、温补效应这一学术思想[1-2]，其中，“温通”即“以温促通”，“通”具有通畅、通达、通调等含义，艾灸温通效应可以产生人体气血运行通畅的效应，即借助灸火的热力作用于机体特定腧穴或部位，通过疏通经络使气血运行通畅，最终正气得复而邪气得去，与《灵枢·经水》提出的“十二经之多血少气……与其皆少血气……其治以针艾，各调其经气”一致，即艾灸的温通效应具有通调机体各经气血的作用。

国外研究证实局部热刺激可有效减少心肌缺血梗死面积[3-4]，国内一项研究表明艾灸内关穴预处理对MIRI 大鼠心肌细胞具有保护作用[5]，由于内关穴主治心脏疾病及经脉循行部位的其他疾病[6-7]，对治疗心脏疾患具有特异性，且课题组前期研究也证实[8-11]：选用内关穴电针可增加心肌组织内源性保护物质活性和含量，同时减少相关物质的释放以促进MIRI心肌组织形态和超微结构修复，最终对MIRI 大鼠心肌产生保护作用。而心肌细胞中B 细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在MIRI 中具有重要作用，故本研究以此展开，以MIRI 大鼠为实验对象，探讨艾灸内关穴预处理对大鼠MIRI 的预保护作用是否与心肌细胞中Bcl-2、HIF-1α 及Caspase-3 的变化有关，为艾灸温通理论对MIRI 的保护机制提供进一步实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

40 只SD 大鼠（SPF 级）由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号:SCXK(湘)2011-0003，体质量250～350 g，雌雄各半。 所有大鼠适应性喂养7 d 后随机分为4 组，每组10 只，即：正常组、模型组（MIRI 模型）、艾灸5 d 组（艾灸内关5 d+MIRI 模型）、艾灸10 d 组（艾灸内关10 d+MIRI模型）。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 TGL-18R 台式冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；HH-S2 恒温水浴箱（河南金博仪器制造有限公司）；QL-901 漩涡混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；164-5050 电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；E-201-C精密PH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；DY89-1 电动玻璃匀浆器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；PIKO REAL 96 荧光定量RCP 仪、SPL0960 荧光PCR 板（美国Thermo 公司）；DYCZ-24EN 电泳槽、DYCZ-40A 转膜仪、DYCP-31DN 水平琼脂糖电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.2.2 主要试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、丽春红（美国Sigma 公 司）、HRP goat anti-mouse IgG（美国Proteintech 公司）、RIPA 裂解液（中国北京普利莱基因技术有限公司）、蛋白酶抑制剂（德国Merck公司）、蛋白磷酸酶抑制剂（瑞士Roche 公司）、SuperECL Plus 超敏发光液（美国Thermo pierce 公司）、逆转录试剂盒（加拿大Fermentas 公司）。

1.3 模型制备

将SD 大鼠仰卧位固定于操作台之上，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），去毛后碘伏常规消毒，打开胸腔，将心包膜轻轻剪破，小心提起左心耳，将0 号线穿于冠状动脉左前降支1/3处，采用硅胶管结扎，以大鼠ST 段改变及冠脉向外膨胀发绀为成功结扎，结扎40 min 后剪开硅胶管，即恢复左前降支灌流60 min[5，12]。

1.4 穴位定位

内关穴：前肢内侧腕关节上方约3 mm 左右尺桡骨缝间[13]。

1.5 艾灸方法

将大鼠仰卧位固定于鼠板之上，内关穴处去毛，将2 支点燃后的艾条分别固定，将燃烧端对准大鼠双侧内关穴皮肤上方约0.5 cm 处，及时弹去艾灰并调整施灸距离，将穴区温度控制在42 ℃左右，每次20 min，每天1 次，艾灸5 d 组与艾灸10 d 组大鼠分别艾灸5 d 与10 d。正常组与模型组同时只捆绑束缚20 min，不艾灸，连续5 d。

实验用艾条由南阳汉医艾绒有限责任公司（豫卫健用字〔2004〕第N0248 号）提供，规格为4 mm×120 mm×90 支。

1.6 检测指标及方法

实验第1 天对正常组进行腹主动脉采血，摘取大鼠心脏组织，经处理后进行相应指标检测；于实验第5 天对模型组、艾灸5 d 组大鼠，实验第10 天对艾灸10 d 组大鼠进行分别心肌缺血再灌注处理，然后进行腹主动脉采血，摘取大鼠心脏组织，经处理后进行相应指标检测。

1.7 Western blot 检测心肌细胞中Bcl-2、HIF-1α、Caspase-3 的表达

1.7.1 样品制备 剪取0.25 g 心肌组织，用冰预冷的PBS 冲洗后置于匀浆器中，加入300 μL RIPA裂解液后反复研磨，直至肉眼看不见组织块；研磨后置于冰上蛋白裂解30 min；并于4 ℃低温离心机中离心15 min（12 000 rpm），将离心后的上清分装转移至0.5 mL 的离心管中，冻存于-20 ℃冰箱。

1.7.2 蛋白浓度检测 按照BCA 蛋白定量试剂盒（Wellbio，YX-W-C202）使用说明操作，测定三者蛋白浓度。

1.7.3 杭原抗体反应 经电泳、转模、封闭、一抗孵育[用1×TBST 将一抗按照Caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、HIF-1α（1∶200）、β-actin（1∶4 000）比例稀释，将膜与一抗一起孵育，4 ℃过夜。孵育结束，1×TBST 洗3 次，每次15 min。]、二抗孵育（用1×TBST 稀释HRP 标记的二抗，稀释比例为1∶3 000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45～60 min。 孵育结束，1×TBST 洗3 次，每次15 min。 ）后，行ECL 显影冲洗曝光。

1.8 RT-PCR 检测心肌细胞中Bcl-2、HIF-1α、Caspase-3 mRNA 的相对表达

1.8.1 实验前准备 将1 mL DEPC 加入121 ℃，20 min 湿热灭菌三蒸水中摇匀16 h， 制备0.1% DEPC水；将提取RNA 所需器械及耗材浸泡于1% DEPC水中过夜，第二天捞起用纸包装好，121 ℃，60 min湿热灭菌后，备用。

1.8.2 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 Trizol 提取心肌细胞总RNA 后，配制1%变性琼脂糖凝胶，取2 μL RNA后按1∶5 的比例与loading buffer premix 混匀，于170 V 恒压电泳，溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长2/3处停止电泳；凝胶成像。

1.8.3 RNA 反转录 以组织总mRNA 为模板，逆转录cDNA，20 μL 反应体系（0.2 mL 无酶PCR tube管）下，取1 μL RNA（约3 μg）、1 μL Random primer、10 μL 无菌无酶水理水，70 ℃加热5 min，迅速插入冰中冷却，再依次加入4 μL 5×Reaction buffer、2 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor，37 ℃加热5 min，再加入1 μL M-MLV 逆转录酶（200 units）、42 ℃，1 h；72 ℃反应10 min。 所得cDNA 于－20 ℃冻存。

1.8.4 qRT-PCR 引物序列 采用SYBR 法，在NCBI 上搜索目的基因序列，并用Primer 5 软件设计（南京金斯瑞合成引物）。

1.9 统计学分析

本研究所得实验数据以SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以“±s”表示，先进行正态性、方差齐性检验。 满足正态性，则组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时选择LSD 法，方差不齐时选择Dunnett T3 法；不满足正态性则选择秩和检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艾灸预处理对MIRI 心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠心肌细胞中HIF-1α及Caspase-3 的蛋白表达显著增高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，艾灸5 d组和艾灸10 d 组大鼠心肌细胞中HIF-1α 及Caspase-3 的蛋白表达显著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达显著增高（P＜0.01）；与艾灸5 d 组相比，艾灸10天组大鼠心肌细胞中HIF-1 α 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），Bcl-2 蛋白表达显著增高（P＜0.05），Caspase-3 的蛋白表达显著降低（P＜0.01）。 见表1。

表1 各组大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的比较（±s，n=10）

注：与正常组相比，★★P＜0.01；与模型组相比，▲▲P＜0.01；与艾灸5 d组相比，●P＜0.05，●●P＜0.01

组别正常组模型组艾灸5 d组艾灸10 d组HIF-1α 0.245±0.103 0.962±0.132★★0.687±0.103▲▲0.627±0.217▲▲Bcl-2 0.674±0.080 0.439±0.052★★0.634±0.075▲▲0.697±0.069▲▲●Caspase-3 0.288±0.071 0.428±0.086★★0.293±0.097▲▲0.280±0.053▲▲●●

2.2 艾灸预处理对MIRI 心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠心肌细胞中HIF-1α及Caspase-3 的mRNA 表达显著增高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，艾灸5 d 组和艾灸10 d 组大鼠心肌细胞中HIF-1α 及Caspase-3 的mRNA 表达显著降低（P＜0.01 或P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表达显著增高（P＜0.01）；与艾灸5 d 组相比，艾灸10 d 组大鼠心肌细胞中HIF-1α和Caspase-3 的mRNA 表达显著降低（P＜0.01 或P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达的比较（±s，n=10）

表2 各组大鼠心肌细胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达的比较（±s，n=10）

注：与正常组相比，★★P＜0.01；与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与艾灸5 d 组相比，●P＜0.05，●●P＜0.01

组别正常组模型组艾灸5 d组艾灸10 d组HIF-1α 0.584±0.054 0.753±0.046★★0.653±0.057▲▲0.601±0.046▲▲●Bcl-2 3.968±1.588 0.986±0.412★★1.928±0.300▲▲1.824±0.632▲▲Caspase-3 0.973±0.118 1.673±0.540★★1.373±0.214▲1.179±0.656▲▲●●

3 讨论

心肌细胞的大量凋亡是MIRI 过程中最主要的分子生物变化，而Bcl-2 家族蛋白在细胞凋亡过程中伴有重要角色，其机制主要通过抑制Caspase 蛋白酶等物质活性而发挥抗细胞凋亡作用[14-15]，当心肌细胞受损或凋亡时其表达显著下降[16]。HIF-1α 是细胞内保持氧稳态调控的转录因子，在细胞缺氧调节中起重要作用，低氧状态下可诱导细胞增强HIF-lα 蛋白水平和HIF-1 DNA 结合活性，使得细胞HIF-lα 表达水平增加，激活细胞膜上的酸敏感离子通道，最终进一步破坏心肌细胞[17-18]。Caspase-3是细胞凋亡过程中重要的凋亡蛋白酶[6]，可导致细胞凋亡，其活化后作用于特异性底物，使得细胞发生相关生化及形态学改变致使细胞凋亡[19]。本研究中，艾灸组大鼠心肌细胞内Bcl-2 的蛋白表达及mRNA含量均有所增高，同时HIF-1α 和Caspase-3 的蛋白表达及mRNA 含量与模型组相比均有所降低，提示艾灸预处理可以缓解大鼠MIRI 所引起的心肌缺氧状态、心肌细胞损伤、增殖活性抑制或细胞凋亡，最终起到保护作用；与艾灸5 d 组相比，艾灸10 d 组大鼠心肌细胞中Bcl-2 的蛋白表达更高，HIF-1α 基因表达更低，Caspase-3 的蛋白和基因表达更低，提示艾灸10 d 在缓解MIRI 所引起的心肌细胞细胞凋亡方面稍优于艾灸5 d，这充分体现了艾灸效应的程度性和差异性作用特点，提示下一阶段研究增设多组不同艾灸时间组可能更好的证实这一点。

古代关于艾灸温通作用的相关论述众多，如《灵枢·刺节真邪》中“火气已通，血脉乃行”是关于艾灸温通效应最早的记载；《伤寒论》云：“少阴病，吐利，手足不逆冷……脉不至者，灸少阴七壮……少阴病脉不至”，提示可用灸法以温通阳气而复脉；元·罗天益《卫生宝鉴·中风灸法》曰：“凡治风莫若续命汤……要收全功，必须火艾为良”，提出对于中风患者艾灸疏通血脉是治疗的关键；清·吴亦鼎《神灸经纶·说原》记载：“灸者，温暖经络，宣通气血……滞者得行”，提出灸法以温促通是通过促进和保持机体气血运行通畅。 现代研究也表明，不同温热刺激可以引起不同的生物学效应， 温度低于50 ℃时血管扩张，血流加快，高于50 ℃时血管收缩，血流减慢[20]。 本研究采用的艾条温和灸多为较低的温热刺激， 与课题组提出的以温促通——“温通” 不谋而合。MIRI 临床可据其表现归属为“心痛”“胸痹”范畴[21-22]，其主要病机为心脉痹阻，病位在心，多因气血不足，心脉失养，不荣则痛，或心脉气滞、血瘀、寒凝等痹阻， 不通则痛。 内关穴为手厥阴心包经之络穴，出属心包络，代心受邪，故临床上用于治疗心疾血证，主治心脏疾病及经脉循行部位的其他疾病[18-19]。有研究指出：艾灸内关穴预处理对MIRI 的保护作用无外乎取艾灸温通效应中的温阳行痹、通脉止痛之义[5]，从本研究结果看，艾灸温通效应对MIRI所引起的心肌细胞损伤具有保护作用，进一步为艾灸温通理论提供理论支撑，同时也为艾灸温通理论提供了科学的诠释。