减数分裂恢复前期小鼠卵巢组织中M-CSF和NPPC的表达曲线

刘畅 张治芬

近年研究认为，排卵前促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰可明显降低卵泡内C型尿钠肽前体（natriuretic peptide precursor type C，NPPC）及环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）表达水平，使得卵母细胞减数分裂恢复，但LH受体仅位于壁层颗粒细胞表面，卵丘颗粒细胞及卵母细胞表面均无LH受体[1]，故LH如何将排卵及减数分裂恢复的信号传至卵母细胞尚无定论。

巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是由单核吞噬细胞产生的一种特异性生长因子，属于造血因子的范畴。1992年Arceci等[2]研究发现妊娠期输卵管及子宫均表达M-CSF，在卵母细胞、着床前胚胎和胎盘中亦可检测到M-CSF受体（macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CS－FR）的表达，由此推测M-CSF参与调节卵母细胞的成熟。随后有研究发现M-CSF基因缺失小鼠发情周期延长，成熟卵泡减少，排卵率降低，而给予补充M-CSF后可逆转上述改变[3]，证实了M-CSF在卵泡发育成熟及排卵中的重要作用。那么，LH导致卵母细胞减数分裂恢复及排卵是否与M-CSF及其受体的信号传导相关，值得进一步深入研究。以往研究中并未在LH/人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotophin，hCG）峰后观察M-CSF、M-CSFR、NPPC基因及其编码的C型尿钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）表达的时间变化曲线。故本研究拟通过动物实验探索hCG促排卵后4 h内卵巢组织中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白及mRNA表达的变化曲线，探索M-CSF及其受体对NPPC表达的影响，推测其在减数分裂恢复中的作用机制，为女性排卵障碍的诊治提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 免疫组化法中兔抗小鼠M-CSF一抗、兔抗小鼠M-CSFR一抗购于英国Abcam公司；二抗（山羊抗兔抗体）和DAB显色剂购于丹麦DAKO公司；荧光定量PCR法中RNeasy miRNA提取试剂盒和引物购于美国Invitrogen生物科技有限公司，其他实验化学试剂购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要仪器 RM2016型病理切片机购于上海徕卡仪器有限公司；Nikon Eclipse Ti-SR倒置荧光显微镜为日本尼康公司产品；JB-P5型包埋机购于武汉俊杰电子有限公司；Step one plus型ABI 7500荧光定量PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品。

1.3 实验动物 SFP级雌性青春期前（25 d龄）C57BL/6小鼠共15只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江省医学科学院动物中心 [实验动物许可证号码：SYXK（浙）2014-0008]。

1.4 小鼠模型的建立 小鼠腹腔注射5 U孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）进行预处理，促进卵泡发育；48 h后腹腔注射5 U hCG诱发排卵，注射后 0、0.5、1、2、4 h分别处死小鼠 3只并做好标记，以眼科剪快速取出卵巢组织，避免用手或镊子挤压。一侧卵巢组织立即投入10%甲醛固定液中浸没并编号，待HE染色和免疫组化法分析其M-CSF、MCSFR、CNP蛋白表达情况；另一侧卵巢组织分离后立即-80℃冰冻保存，以备荧光定量PCR检测。动物饲养和实验操作过程符合《实验动物饲养管理和使用指南》的规定。

1.5 HE染色观察卵巢组织中各级卵泡的发育情况卵巢组织固定24 h后常规HE染色（切片厚度5 μm），光镜下观察卵巢组织内各级卵泡结构特征。

1.6 免疫组化法检测卵巢组织中NPPC、M-CSF及MCSFR的蛋白表达 将卵巢组织石蜡切片脱蜡水化，抗原修复后磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤，3%过氧化氢（H2O2）室温避光孵育20 min阻断内源性过氧化物酶，再以pH=7.4的PBS洗涤。以含5% FBS白蛋白稀释一抗，稀释比例1：200，于4℃孵育过夜。玻片洗涤后滴加二抗，室温孵育50 min。DAB显色，Harris苏木素复染，脱水后中性树胶封片。选取包含排卵前卵泡的卵巢组织切片为计算对象，随机挑选3个200倍视野拍照。应用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.USA）软件，选取相同的棕黄色作为阳性判断的统一标准，分析出阳性区域累积光密度值（integrate optical density，IOD），根据图片中卵巢组织所占面积（AREA），通过公式IOD/AREA，计算平均光密度值。

1.7 荧光定量PCR检测卵巢组织中NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表达 取出冻存标本，严格按照说明书操作流程，使用RNeasy miRNA提取试剂盒分离提取RNA，通过荧光定量PCR仪分别测定NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表达水平，内参基因选择Rpl19。引物合成于武汉谷歌生物科技有限公司，引物序列见表1。所有检测至少重复3次。

表1 引物序列

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，各时点间比较采用One-Way ANOVA。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 排卵前卵泡发育情况 卵巢组织切片HE染色后可见窦前卵泡（preantral follicle，PF）、窦卵泡（antral fol－licle，AF）。成熟卵泡内各部分结构清晰可见，其中卵泡最外层的线性结构为卵泡膜，紧贴卵泡膜分布的颗粒细胞为壁层颗粒细胞（mural granulosa cells，mGCs），mGCs内侧紧贴卵母细胞（Oocyte，Oo）的颗粒细胞为卵丘颗粒细胞（cumulus cells，CCs），mGCs与 CCs之间的空腔为卵泡腔（follicullar antrum，FA），内充满卵泡液，位于CCs中央的是Oo。CCs与Oo形成的复合体称卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex，COC），见图1（插页）。卵巢组织中卵泡发育不同阶段，各阶段卵泡及卵泡内结构均可见，说明促排卵小鼠模型建立成功。

图1 小鼠卵巢组织中各级卵泡结构（HE染色，×100）

2.2 卵巢组织中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白的表达定位 免疫组化检测发现M-CSF及M-CSFR在卵泡中mGCs、CCs均有表达；CNP主要由mGCs表达，尤其是与CCs相连部分的mGCs中表达较明显，CCs也有少量表达，见图2-4（插页）。

图2 M-CSF在卵巢组织中的表达（HE染色，×100）

图3 M-CSFR在卵巢组织中的表达（HE 染色，×100）

图4 CNP在卵巢组织中的表达（HE 染色，×200）

2.3 卵巢组织中各时点M-CSF、M-CSFR及CNP蛋白表达水平的变化 促排卵后小鼠卵巢组织中M-CSF蛋白表达水平于2、4 h明显下降，与其他时间点比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），M-CSFR蛋白表达水平随着时间的延长逐渐降低，各时点平均光密度值之间的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。此外，CNP表达水平在1、2 h显著增高，与其他时点比较，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），而 0、0.5、4 h之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见图 5。

2.4 卵巢组织中各时点 M-CSF、M-CSFR及 NPPC mRNA的表达水平变化 促排卵后小鼠卵巢组织中NPPC mRNA表达水平1、2 h显著升高，与其他时点比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而M-CSF、MCSFR mRNA在注射hCG后均呈持续低水平表达，各时点之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图6。

图5 卵巢组织中各时点巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）及C型尿钠肽（CNP）蛋白表达水平的变化（注：与其他时点比较，*P＜0.05）

3 讨论

集落刺激因子家族（colony-stimulating factors，CSFs）是一组18～70 kDa的不稳定糖蛋白，主要包括3种：M-CSF，亦称CSF-1；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF），亦称CSF-2；粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF），亦称 CSF-3。M-CSF可提高吞噬细胞杀伤肿瘤细胞和微生物的能力，还作用于生殖细胞，影响卵巢功能，促进胎盘滋养细胞发育、协助胚胎生长等，参与机体生殖内环境平衡的维持。有研究发现，M-CSF可促进卵泡发育及排卵，并增加颗粒细胞的增殖能力[3]。本实验中，通过免疫组化法研究发现促排卵小鼠卵泡内M-CSF及其受体分布广泛，mGCs及CCs均有表达，故推测其在卵泡发育成熟及减数分裂恢复的过程中很有可能起着重要的作用。

本研究从蛋白及mRNA两方面测定卵巢组织中M-CSF表达水平，结果提示在hCG刺激后，M-CSF表达呈下降趋势，直至较低水平。以往研究表明，正常月经周期卵泡发育过程中，血清M-CSF及其受体表达呈上升趋势，并在排卵日达到峰值[4]，这与逐渐升高的雌激素及促性腺激素水平相关[5]，Zhang等[6]的研究也提出类似结论。在卵泡发育早中期，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）刺激颗粒细胞分泌雌二醇（estradiol，E2）和M-CSF，不断增加的E2水平反过来刺激卵泡内颗粒细胞和巨噬细胞分泌M-CSF。而M-CSF可能与FSH存在协同作用，共同促进卵泡发育及雌激素的分泌；到了卵泡晚期，随着体内雌激素浓度的进一步上升，抑制了M-CSF的分泌，以减弱其与FSH的协同作用，防止卵泡的过度生长，同时避免M-CSF的其他生物学效应，从而维持内环境稳态。结合本研究，推测高剂量的LH/hCG刺激后，卵泡内M-CSF及其受体水平表达持续下降至低水平，这与LH峰之前雌激素峰以及LH峰后低雌激素水平相关。

图6 卵巢组织中各时点巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子受体（M-CSFR）及C型尿钠肽前体（NPPC）mRNA表达水平的变化（注：与其他时点比较，*P＜0.05）

本实验中还通过免疫组化定位CNP的表达，结果显示卵巢组织中CNP主要表达于mGCs上，同时CCs上亦有少量表达。这与以往的研究有所偏差，之前认为CNP仅表达于mGCs表面[6]，考虑由于免疫组化法结果与实验人员主观判断相关性较大，进一步可以行卵泡内原位杂交PCR法以确认。

mGCs中CNP与CCs上钠尿肽受体 2（natriuretic peptide receptor 2，NPR2）结合后，刺激CCs合成并分泌cGMP。体外培养COCs时加入NPPC，可发现CCs和Oo内的cGMP含量升高，从而阻止生发泡破裂[7]。还有一项动物研究显示，NPPC或者NPR功能缺失或基因敲除的小鼠体内Oo往往会出现早发的减数分裂恢复[6]。以上研究结果均证实，NPPC以及其同源性受体NPR2在维持减数分裂停滞中具有重要作用。有研究运用RT-PCR分析显示，小鼠卵泡液中NPPC mRNA及CNP蛋白表达水平均随着卵泡的生长发育而呈上升趋势[8]。近些年国内外研究已初步认可以NPPC/NPR2系统为核心的减数分裂调控模型，认为LH峰可抑制卵巢颗粒细胞分泌CNP，减少CNP与NPR2结合，减少cGMP的合成，从而促进减数分裂恢复[6]。且有研究指出，LH峰后2～3 h可见CNP明显下降[9]。本研究中从mRNA与蛋白水平分别测定hCG促排卵后4 h内NPPC/CNP水平变化发现，在hCG注射后1 h，NPPC mRNA水平达高峰后随即快速下降，2 h时CNP水平达高峰，随后亦快速下降至较低水平，这与上述研究结果一致，提示LH/hCG可能通过某途径下调NPPC/CNP以启动减数分裂恢复。而hCG刺激后短时间内NPPC/CNP表达增加，考虑是其在卵泡期表达趋势的延续，如成熟促进因子等的作用结果。笔者推测排卵前卵巢组织中NPPC基因水平的变化曲线与外周血雌激素、LH变化曲线相类似，CNP蛋白水平在LH/hCG峰后2 h出现峰值，随后快速下降至较低水平，继而影响卵泡内cGMP及环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，最终导致 Oo 生发泡破裂及排卵。

综上所述，本研究结果显示在促排卵小鼠卵巢组织中，M-CSF及M-CSFR分布广泛，在mGCs及CCs中均有表达，而CNP主要表达于mGCs，CCs中仅少量表达。在LH/hCG促排卵后卵巢组织中M-CSF、M-CSFR水平随即出现下降趋势，NPPC mRNA呈上升趋势并在1 h达高峰后显著下降，CNP蛋白在2 h上升至峰值后随即快速下降至较低水平，推测卵母细胞减数分裂恢复前期NPPC mRNA水平在LH/hCG峰刺激下上升至峰值后下降，其变化曲线与外周血雌激素及LH类似。