miR-455对子宫内膜间质细胞氧化应激的调控作用及相关机制研究

唐文波 王霖霖 杨雪 陈藕景

据统计，10%～15%的育龄期女性患有子宫内膜异位症[1]。子宫内膜异位症的病因存在多种假说[2-4]，但是至今尚未达成一致。有研究提示氧化应激可能通过诱发腹膜腔内的广泛炎症反应参与子宫内膜异位症的发生过程[5]。因此，抑制氧化应激或许是治疗子宫内膜异位症的方式之一。miRNA是一类在转录后水平通过抑制蛋白翻译和促进mRNA降解调控基因表达的短片段非编码RNA[6]。miRNA参与调控多种生物学过程，其中包括氧化应激[7-9]。研究表明miR-455通过激活Nrf2信号通路对成骨细胞的氧化应激损伤发挥保护作用[10-11]。然而，至今尚不明确miR-455是否能够减轻人子宫内膜间质细胞（human endometrial stromal cell，HESC）的氧化应激。脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein 4，FABP4）是一种15kDa大小的脂蛋白，参与多种生物学过程[12]。研究表明，FABP4在脂肪细胞中降低了氧化应激和内质网应激，敲除FABP4基因可引起细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高[13-14]。这说明FABP4在氧化应激调控中扮演重要角色，其是否在子宫内膜异位症发生、发展中发挥一定作用呢？基于此，本研究首先确认miR-455是否为一种潜在的FABP4靶向miRNA，再通过过表达miR-455来研究其对过氧化氢诱导的HESC毒性的保护作用，并进一步通过沉默和过表达FABP4调控miR-455的表达来研究miR-455调节子宫内膜间质细胞对氧化应激的反应及相关机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HESC购自上海佰晔生物科技中心。DMEM培养液为美国HyClone公司产品。miR-455模拟物（miR-455 mimics）、阴性对照 mimics（miR-NC）、FABP4 siRNA（si-FABP4）和 pcDNA3.1-FABP4（pcFABP4）、两段包含突变型和野生型FABP4基因3′UTR序列的寡核苷酸序列、双荧光素酶试剂盒均购自上海吉玛制药技术有限公司。CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒、Trizol试剂、流式细胞仪、细胞凋亡率检测试剂盒、ABI 7500 PCR仪、ELISA酶标仪均购自赛默飞世尔科技公司。miScript SYBR-Green PCR试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 HESC培养于含10% FBS及100 U/ml青链霉素的DMEM与Ham’s F-12混合培养基，置于含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱，2～3 d换液1次。细胞转染通过Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒完成。转染过程：取50 pmol的miR-455 mimics，加入一定量的无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为 25 μl。取 1 μl的 Lipofectamine 2000，然后加入24 μl无血清稀释液体，充分混匀，制成稀释液，终体积为 25 μl。室温静置 5 min。将 Lipofectamine 2000 稀释液和RNA稀释液充分混合，室温静置15 min。转染复合物制备完成。将50 μl转染复合物滴加到有0.45 ml全培养基（含有10%血清和抗生素）的细胞上，混合均匀。转染6 h后观测细胞状态，如状态良好则不必更换培养基，继续培养24 h后收集细胞行进一步的实验。

1.2.2 细胞活性检测 采用CCK-8法。HESC以5 000/孔的密度接种于 96 孔板。经不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）过氧化氢溶液干预24 h后，加入10 μl CCK-8试剂，采用ELISA酶标仪检测波长595 nm处的OD值，以没有接种细胞的孔作为空白对照。实验重复3次以上取平均值。

1.2.3 细胞凋亡情况检测 采用Annexin V-FITC/PI对HESC染色后，通过流式细胞仪检测荧光强度。Annexin V-FITC阴性、PI阴性为存活细胞，Annexin V阳性PI阴性为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC阳性、PI阳性为晚期凋亡细胞。

1.2.4 细胞miR-455表达水平检测 采用实时定量PCR（qPCR）法。采用Trizol试剂从HESC中提取总RNA。取1 μg总RNA采用TIANscriptⅡ cDNA合成试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，采用miScript SYBRGreen PCR试剂盒在ABI 7500 PCR仪中完成qPCR反应。GAPDH和U6作为内参基因。PCR反应条件如下：95 ℃1 min，（95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s）×40 循环。根据 2-ΔΔCt法计算 HESC miR-455 表达水平[15]。

1.2.5 miR-455靶点筛选与验证 采用生物信息学数据库TargetScan和StarBase V2.0。为检测FABP4是否为miR-455的直接靶点，将FABP4的3′-UTR插入pmir－GLO双荧光素酶miRNA靶表达载体中（野生型MT），第二种载体中，假定miR-455在FABP4的3′-UTR中的结合位点发生突变（突变型Mut），并插入到pmirGLO载体中。通过转染方法使HESC过表达miR-455，从而观察两种载体FABP4 3′UTR的荧光素酶活性。通过转染si-FABP4成功抑制HESC FABP4的表达，另将miR-455 mimics和FABP4过表达载体单独或联合转染HESC，使HESC中miR-455和FABP4过表达。比较沉默FABP4的HESC与空白对照的HESC，及FABP4、miR-455联合过表达的HESC与过表达miR-455的HESC存活率、凋亡率，方法同1.2.2、1.2.3。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HESC加入不同浓度过氧化氢溶液中培养24 h后凋亡率比较 见图1。

图1 人子宫内膜间质细胞（HESC）加入不同浓度的过氧化氢溶液培养24 h后凋亡率比较（a：流式细胞图；b：细胞凋亡率比较）

由图1可见，与0 μmol/L浓度过氧化氢溶液处理的 HESC 比较，5、10、20 μmol/L 浓度过氧化氢溶液处理的HESC凋亡率上升（均P＜0.05）。

2.2 HESC加入不同浓度过氧化氢溶液中培养24 h后miR-455表达水平比较 见图2。

图2 人子宫内膜间质细胞（HESC）加入不同浓度的过氧化氢溶液中培养24 h后miR-455表达水平比较

由图2可见，与0 μmol/L浓度过氧化氢溶液处理的 HESC 比较，5、10、20 μmol/L 浓度过氧化氢溶液处理的HESC miR-455表达水平均下降（均P＜0.05）。

2.3 过表达miR-455的HESC与空白对照的HESC存活率、凋亡率比较 见图3。

图3 过表达miR-455的人子宫内膜间质细胞（HESC）与空白对照的HESC存活率、凋亡率比较

由图3可见，20 μmol/L浓度过氧化氢溶液处理后，与空白对照的HESC比较，过表达miR-455的HESC存活率上升、凋亡率下降（均P＜0.05）。

2.4 miR-455的潜在靶点筛选结果 采用生物信息学工具TargetScan和StarBase V2.0筛选miR-455的潜在靶点，显示miR-455可能靶向FABP4 mRNA的3′-UTR。

2.5 沉默FABP4的HESC与空白对照的HESC存活率、凋亡率比较 见图5。

图5 沉默脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的人子宫内膜间质细胞（HESC）与空白对照的HESC存活率、凋亡率比较

由图5可见，20 μmol/L浓度过氧化氢溶液处理后，与空白对照的HESC比较，沉默FABP4的HESC存活率上升、凋亡率下降（均P＜0.05）。

2.6 FABP4、miR-455联合过表达的HESC与过表达miR-455的HESC存活率、凋亡率比较 见图6。

图6 沉默脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、miR-455联合过表达的人子宫内膜间质细胞（HESC）与过表达miR-455的HESC存活率、凋亡率比较

由图6可见，20 μmol/L浓度过氧化氢溶液处理后，与过表达miR-455的HESC比较，FABP4、miR-455联合过表达的HESC存活率下降、凋亡率上升（均P＜0.05）。

3 讨论

本研究探讨了miR-455对HESC氧化应激的影响。结果显示，HESC miR-455表达水平随过氧化氢溶液浓度升高呈剂量依赖性降低。miR-455异位表达减弱了过氧化氢诱导的HESC细胞破坏作用。进一步，FABP4被证实是miR-455的靶基因。由于氧化应激导致了腹膜腔中广泛的炎症反应，在子宫内膜异位症的病理生理过程中发挥重要作用，本研究结果表明miR-455或可用于优化子宫内膜异位症的临床治疗。

过氧化氢在体外实验模型中被广泛用作氧化应激的诱导物。过氧化氢进入细胞质后产生毒性更强的羟自由基，其与脂类、蛋白质、DNA等大分子物质相互作用，进而导致细胞损伤[15]。CCK-8检测和流式细胞分析被广泛用于评估化学品对细胞增殖和凋亡的影响，这两项检测技术在本研究中被用于评估过氧化氢诱导的细胞损伤。本研究结果显示，过氧化氢以剂量依赖性的方式降低了HESC的存活率，而增加了其凋亡。与此同时，过氧化氢也以剂量依赖性的方式降低了细胞内miR-455的表达水平。尽管目前没有研究报道miR-455对HESC氧化应激的保护作用，Xu等[11]的研究显示miR-455通过靶向cullin3激活Nrf2信号通路，从而对过氧化氢诱导的人成骨细胞损伤起到保护作用。Zhang等[10]研究也表明miR-455通过激活Nrf2/ARE通路对成骨细胞氧化应激发挥保护作用。本研究结果进一步明确了miR-455过表达显著减轻了HESC的氧化应激，同时也显示，过氧化氢通过下调miR-455表达的方式抑制HESC增殖。

多项研究显示过氧化氢诱导的氧化应激在体外条件下诱发细胞凋亡[16-17]。本研究结果与前人结果类似，显示相对低浓度的过氧化氢就能诱导细胞凋亡。在本研究中，miR-455的异位表达显著抑制了过氧化氢诱导的HESC凋亡。因此，本研究得出结论，miR-455减弱了氧化应激，从而对过氧化氢诱发的HESC损伤发挥保护作用。

FABP4在本研究中被证明是miR-455的直接靶点。FABP1是FABP家族中的另一成员，已有研究表明FABP1通过其甲硫氨酸和半胱氨酸中和自由基[18]。然而，FABP4在调控氧化应激中的作用仍存在争议。许多研究显示抑制FABP4能够在多种模型中抑制炎症反应和氧化应激[19-20]。本研究表明，下调FABP4表达产生了与miR-455类似的抗氧化效应，而FABP4过表达则消除了这一效应。因此，本研究提示靶向FABP4可能是抑制氧化应激、治疗子宫内膜异位症的有效方法。

综上所述，本研究结果提示了miR-455抑制HESC氧化应激新的可能机制，FABP4是miR-455的直接靶基因。miR-455或可作为治疗子宫内膜异位症的有效靶点。