槲皮素对甲基乙二醛诱导的成骨细胞凋亡保护作用研究

金杯 戴盼盼 孙旺 顾卫燕 林海升 施更生

牙周炎是常见的口腔慢性疾病，与糖尿病相互影响且互为易感因素[1-2]。糖尿病患者牙周组织破坏更显著，疾病发展更迅速，是目前临床研究的难点。研究发现，细胞凋亡贯穿糖尿病性牙周炎的发生、发展[1]，而成骨细胞凋亡在牙周炎牙槽骨吸收中起关键作用。甲基乙二醛作为牙周炎与糖尿病的共同致病因素，可由牙周炎致病菌福赛类杆菌产生[3]，并且在糖尿病患者血清中高浓度存在，与糖尿病以及肾病、心血管病、白内障等多种糖尿病并发症密切相关。槲皮素是一种人类饮食中广泛存在的天然黄酮类化合物，具有强大的抗氧化和抗炎活性，并被认为在治疗和预防包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病在内的疾病中发挥作用，已被证实具有抗糖尿病潜力[4]。糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）负向调控转录因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2），与细胞抗氧化、抗炎和抗凋亡等能力有关[5]。Bcl-2家族蛋白，包括Bcl-2和Bax，在线粒体凋亡级联反应中发挥着重要作用。Bcl-2位于线粒体外膜上，起着抑制凋亡作用，而Bax移位到线粒体上，增加线粒体膜的通透性，促进细胞色素C的释放，进而启动凋亡。因此，目前认为细胞内Bcl-2、Bax这两种对立蛋白的比率关系是决定细胞凋亡的关键[6]。本研究通过体外培养成骨细胞，观察甲基乙二醛处理对细胞Bcl-2、Bax表达及GSK－3β/Nrf2信号通路的影响及槲皮素的干预作用，以期为槲皮素在糖尿病牙周炎的临床应用提供理论基础，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）细胞株：小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞系购自美国ATCC细胞库。（2）药物与试剂：α-MEM细胞培养基、FBS、胰蛋白酶（美国Gibco公司），甲基乙二醛、槲皮素、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、β-actin一抗（美国Sigma公司），Bcl-2、Bax、p-GSK－3β（Ser9）、GSK－3β、Nrf2 一抗（美国Cell Signaling Technology公司），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美国 Invitrogen公司），TUNEL试剂盒（瑞士Roche公司），二抗（上海碧云天生物技术有限公司）。（3）主要仪器：酶标仪（美国Bio-TEK公司），流式细胞仪（美国Becton公司），正置荧光显微镜（德国Leica公司），电泳仪、曝光仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将MC3T3-E1细胞接种于含10% FBS和100 U/ml青霉素G和100 ng/ml链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱培养备用。

1.2.2 细胞分组与处理 将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞随机分为4组。（1）对照组：MC3T3-E1细胞用α-MEM培养基（加入FBS）培养。（2）甲基乙二醛组：MC3T3-E1细胞用半数抑制浓度的甲基乙二醛培养24 h。（3）槲皮素组：MC3T3-E1细胞用6.25 μmol/L槲皮素培养25h。（4）槲皮素+甲基乙二醛组：MC3T3-E1细胞用6.25 μmol/L槲皮素预培养1 h，再加入半数抑制浓度的甲基乙二醛培养24 h。

1.2.3 细胞增殖活性检测 采用MTT法。将对数生长期的MC3T3-E1细胞接种于96孔板（104个/孔），培养24 h后按不同分组处理后换α-MEM培养基（无血清），每孔加入 20 μl 5 mg/ml的 MTT ，37 ℃、5% CO2培养箱避光培养4 h。小心吸弃孔内上清液，每孔加入150 μl DMSO，待结晶完全溶解后酶标仪490 nm处检测吸光度值。细胞存活率（%）=（各实验组吸光度值-调零孔吸光度值）/（对照组吸光度值-调零孔吸光度值）×l00%。

1.2.4 细胞凋亡检测 采用Annexin V-FITC/PI双标记结合流式细胞仪以及TUNEL染色法。Annexin V-FITC/PI法：将消化收集的细胞调整密度至106个/ml，室温避光加入Annexin V-FITC，再加入PI，孵育10 min后流式细胞仪检测细胞凋亡。TUNEL染色法：将各处理组细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定1 h，2～8℃温度下通透液（体积分数0.1% Triton X-100和质量分数0.1%柠檬酸钠配成）处理2 min，再用50 μl反应液37℃避光孵育1 h，用含有DAPI的封片剂封片，室温避光24 h后正置荧光显微镜观察拍照，计数300个细胞计算凋亡率。

1.2.5 蛋白表达检测 采用Western blot法。用裂解液（RIPA裂解液与PMSF按100：1的比例配置）充分裂解细胞，超声后高速离心机4℃ 12 000 r/min离心，上清液-80℃分装保存。采用BCA法测定蛋白浓度，将各组蛋白浓度调至相同后与上样缓冲液混合，100℃煮沸10 min使蛋白充分变性。配制5%浓缩胶以及12%分离胶，每孔上样20 μg蛋白，SDS-PAGE电泳分离后湿转法将蛋白电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，将膜分别转入含一抗的稀释液中（Bcl-2、Bax、p-GSK-3β、GSK-3β、Nrf2 1：2 000，β-actin 1：3 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1 h，化学发光成像仪曝光，扫描图像并用Image J软件分析灰度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基乙二醛对成骨细胞的半数抑制浓度 0、100、200、300、400、500、600、700 μmol/L 的甲基乙二醛处理成骨细胞24 h后，细胞存活率分别为100.00%、95.51%、86.21%、77.83%、78.13%、72.10%、48.15%、5.32%（P ＜0.05），说明甲基乙二醛能抑制成骨细胞增殖活性，并呈浓度依赖性，600 μmol/L是甲基乙二醛对成骨细胞的半数抑制浓度，见图1。

图1 不同浓度甲基乙二醛对成骨细胞增殖活性的影响（与对照组比较，*P＜ 0.05）

2.2 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞凋亡情况比较 流式细胞术结果显示甲基乙二醛组细胞凋亡率为41.60%，明显高于对照组（P＜0.05），说明甲基乙二醛诱导细胞死亡类型以凋亡为主。此外，TUNEL染色结果显示，甲基乙二醛组细胞染色阳性率为35.53%，高于对照组（P＜0.05），进一步说明甲基乙二醛可以诱导成骨细胞凋亡，见图2。

2.3 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞Bcl-2、Bax表达水平比较 Western blot结果示，与对照组相比，甲基乙二醛组成骨细胞Bcl-2表达水平下降（P＜0.05），而Bax表达水平升高（P＜0.05），Bcl-2/Bax比率下降，进一步验证甲基乙二醛可诱导成骨细胞凋亡，见图3。

2.4 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞GSK-3β/Nrf2信号通路相关蛋白表达水平比较 Western blot结果示，与对照组相比，甲基乙二醛组p-GSK-3β、Nrf2表达水平均明显下降（均P＜0.05），见图4。

2.5 槲皮素干预对成骨细胞增殖活性的影响 MTT结果所示，低浓度的槲皮素对成骨细胞增殖活性无明显影响，而25、50 μmol/L高浓度的槲皮素处理后细胞存活率分别为89.48%、84.58%，说明高浓度的槲皮素有细胞毒性。此外，与甲基乙二醛组比较，低浓度的槲皮素预处理后能明显恢复细胞增殖活性，6.25 μmol/L的槲皮素保护效果最好，故后续实验采取该浓度，见图5。

2.6 槲皮素+甲基乙二醛组、槲皮素组、甲基乙二醛组、对照组细胞凋亡情况和Bcl-2、Bax表达水平比较 与甲基乙二醛组相比，槲皮素+甲基乙二醛组TUNEL细胞染色阳性率降低（P＜0.05），说明细胞凋亡减少。此外，与甲基乙二醛组相比，槲皮素+甲基乙二醛组Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平下降，进一步说明槲皮素能缓解甲基乙二醛诱导的成骨细胞凋亡，见图6。

图2 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞凋亡情况比较[与对照组比较，*P＜0.05；a：流式细胞图；b：细胞凋亡率比较；c：TUNEL染色结果（×200）；d：TUNEL 阳性细胞率比较]

图3 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞Bcl-2、Bax表达水平比较（与对照组比较，*P＜0.05；a：蛋白电泳图；b：Bcl-2表达水平比较；c：Bax表达水平比较）

图4 甲基乙二醛组与对照组成骨细胞糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/转录因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路相关蛋白表达水平比较（与对照组比较，*P＜0.05；a：蛋白电泳图；b：p-GSK-3β 表达水平比较；c：GSK-3β 表达水平比较；d：Nrf2表达水平比较）

图5 槲皮素干预对成骨细胞增殖活性的影响（a：不同浓度槲皮素对细胞增殖活性的影响；b：槲皮素对甲基乙二醛细胞增殖活性干预的影响）

2.7 槲皮素+甲基乙二醛组、槲皮素组、甲基乙二醛组、对照组细胞GSK-3β/Nrf2信号通路相关蛋白表达水平比较 槲皮素组与对照组细胞p-GSK-3β、Nrf2蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与甲基乙二醛组相比，槲皮素+甲基乙二醛组p-GSK-3β、Nrf2蛋白表达水平升高（均P＜0.05），见图7。

图6 槲皮素+甲基乙二醛组、槲皮素组、甲基乙二醛组、对照组细胞凋亡情况和Bcl-2、Bax表达水平比较[a：TUNEL染色结果（×200）；b：TUNEL 阳性细胞率比较；c：Bcl-2、Bax蛋白电泳图；d：Bcl-2 表达水平比较；e：Bax表达水平比较]

3 讨论

牙周炎是最常见的口腔慢性疾病，是中国成人失牙的首位因素，其作为糖尿病的第六大并发症，两者之间息息相关：牙周感染会降低胰岛素功能，不利于血糖控制；而糖尿病患者抗感染能力降低是牙周病的重要危险因素[7]。因此，糖尿病性牙周炎已成为了牙周病预防及治疗中的难点和重点。牙槽骨破坏是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齿松动和脱落的直接原因。有研究显示，糖尿病牙周炎的发生、发展与细胞凋亡密切相关，在糖尿病病理条件下，牙周支持组织中成骨细胞凋亡增加，进一步限制了骨组织的愈合[1，8]。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于饮食及中草药中，对人体无毒、无三致作用，国内外对其研究日益增多，已被证实具有抗感染、抗氧化等药理活性，并对癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等多种疾病有潜在治疗效果[9]。近年来，槲皮素在糖尿病中的应用被愈发关注。Vieira-Frez等[10]发现槲皮素能缓解糖尿病大鼠神经元细胞、巨噬细胞的氧化应激损伤。Hu等[11]以小鼠为模型发现槲皮素能通过SIRT1/NLRP3通路预防糖尿病脑病。Daniel等[12]证实槲皮素能抑制线粒体膜通道，减少肝细胞凋亡缓解糖尿病大鼠肝损伤。类似的，Roslan等[13]发现槲皮素能缓解糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。因此，本研究初步探讨槲皮素保护成骨细胞的效果及机制。

甲基乙二醛是一种有毒代谢产物，在糖尿病的高糖病理环境下，磷酸酶使磷酸二羟丙酮生成二羟丙酮，进而形成甲基乙二醛。研究发现甲基乙二醛是牙周炎重要致病菌福赛类杆菌的产物，其浓度在牙周炎患者龈沟液中比正常者可高出15～20倍[3]。此外，甲基乙二醛能诱发牙周组织的炎症反应[14]，诱导牙龈成纤维细胞凋亡[15]。本研究发现甲基乙二醛能够抑制成骨细胞增殖活性，并且呈浓度依赖性。此外，流式细胞术结果显示甲基乙二醛能够诱导成骨细胞凋亡。TUNEL染色是对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡，本实验条件下，甲基乙二醛组TUNEL染色细胞阳性率明显高于对照组，说明细胞凋亡增加，与既往实验相符。Western blot结果示线粒体凋亡级联反应中的关键蛋白Bcl-2/Bax比率下降，一般认为抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相互作用并抑制Bax的促凋亡作用，而Bcl-2/Bax比率下降说明Bax蛋白功能占优势，从而发挥促凋亡作用，进一步验证了凋亡结果。而槲皮素干预后显著恢复了甲基乙二醛抑制的成骨细胞增殖活性，同时减少了细胞凋亡，说明其对成骨细胞有很好的保护作用。

图7 槲皮素+甲基乙二醛组、槲皮素组、甲基乙二醛组、对照组细胞糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/转录因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路相关蛋白表达水平比较（与甲基乙二醛组比较，*P＜0.05；a：蛋白电泳图；b：p-GSK-3β表达水平比较；c：GSK-3β表达水平比较；d：Nrf2表达水平比较）

为了进一步揭示槲皮素的作用机制，本研究探讨了GSK-3β/Nrf2信号通路在其中的作用。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能通过降解β连环蛋白从而阻断Wnt通路，影响成骨细胞增殖分化。此外，GSK-3β能调控线粒体膜通道的开放，当其Ser9位点磷酸化后线粒体膜通道开放抑制，减少了线粒体膜通透性，减少细胞色素C的释放，抑制Caspase-3/9活性，从而抑制线粒体凋亡途径，减少细胞凋亡[16]。Nrf2是重要的内源性抗氧化调节因子，当细胞受到氧化应激损伤时，细胞质中Nrf2转移入细胞核，调控大量有抗氧化作用基因表达。研究证实GSK-3β激活后负向调控Nrf2，影响细胞的氧化还原状态，抑制Nrf2的保护作用[17]。Zhang等[18]发现丹酚酸A能通过GSK-3β/Nrf2信号通路抗氧化应激保护肾脏。此外，激活GSK-3β/Nrf2信号通路被证实能缓解糖尿病病理状态下的心肌病[19]以及促进肢体缺血中的血管生成[20]。本研究中甲基乙二醛在诱导成骨细胞凋亡的过程中GSK-3β的Ser9位点磷酸化降低，Nrf2蛋白水平降低，GSK-3β/Nrf2信号通路被抑制。而槲皮素干预后GSK-3β磷酸化水平以及Nrf2蛋白表达水平上升，说明槲皮素对成骨细胞的保护作用可能是通过GSK-3β/Nrf2信号通路来介导的。

综上所述，本研究结果显示，GSK-3β/Nrf2信号通路参与了甲基乙二醛诱导的成骨细胞凋亡，而槲皮素对成骨细胞凋亡的保护作用可能依赖于该通路。但本研究为单纯体外实验，需进一步研究证实，从而为临床应用提供理论基础。