涎腺腺样囊性癌组织SEMA3G表达及甲基化研究

侯秀秀 朱欣 凌志强 朱栩杭 许敏达 赵智翔 葛明华

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）是较常见的涎腺恶性上皮源性肿瘤，可发生于任何大小的涎腺，由于发病隐匿，且具有局部浸润性和沿神经血管扩散的特性，边界难以控制，术后易复发、转移，多数患者预后不良[1-2]。研究表明，SACC发生、发展与多种分子机制有关，其中DNA甲基化在SACC致癌及进展过程中发挥关键作用[3]，如AQP1基因[4]、E-CAD基因[5]、SBSN 基因[6]、RASSF1A 基因[7]、RUNX3 基因[8-10]。近年来，相关基因DNA甲基化与SACC发生、发展的相关性也成为研究热点。信号素分子3G（Semaphorin 3G，SEMA3G）是一种重要的分泌型糖蛋白，属于信号素家族成员，可通过神经菌毛素 2（neuropilin-2，NRP-2）受体、神经丛蛋白（Plexin）与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）结合参与血管生成[11-12]。研究发现SEMA3G在多种恶性肿瘤中呈现不同程度的缺失和表达下调，并且通过多种信号通路发挥抑制肿瘤细胞生长、增殖及侵袭转移的作用[13]。然而，SEMA3G与SACC的相关研究不多。本研究通过免疫组化法检测SEMA3G在SACC组织中的表达水平，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（quantitative methylation-specific PCR,qMSP）检测SEMA3G基因启动子区甲基化水平，探讨其与SACC患者临床病理特征及预后的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2002年2月至2013年12月在中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）接受手术、术前未行放化疗、病例资料保存完整的SACC患者55例，其中男22例，女33例；年龄24～78岁，中位年龄52岁。收集其SACC组织标本，并取相对应的癌旁正常组织作为对照。由3名病理科医师对SACC作诊断分类，其中筛状型30例，腺管型11例，实体型14例；肌层浸润22例，无肌层浸润33例；累及神经24例，未累及神经31例；远处转移5例，无远处转移50例；根据国际抗癌联合会（UICC）2002年第6版TNM分期：Ⅰ～Ⅲ期24例，Ⅳ期31例。本研究经中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集患者的一般资料及临床病理特征，包括性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、组织类型、是否侵犯邻近组织、是否累及神经、是否肌层浸润、是否复发等。手术标本均经甲醛固定，石蜡包埋，连续切片行病理学检查。采用电话回访，统计生存和死亡情况，如电话随访3次无回音，或地址所在派出所查询无此人信息，则定为失访。

1.2.2 SACC组织与癌旁正常组织SEMA3G表达水平检测 采用免疫组化SP法。所有组织切片（4 μm厚）用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，采用EDTA缓冲液高温微波抗原修复，5%过氧化氢溶液清除内源性过氧化物酶，SEMA3G一抗（英国Abcam公司）4℃冰箱静置孵育过夜，二抗室温孵育30 min，DAB显色、苏木素染核、促蓝液染质、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，由3名病理科医师独立阅片打分，取平均值为最终值。评分标准采用半定量法：高倍镜下评估细胞染色强度：未着色为阴性（0分）、淡黄色为弱阳性（1分）、黄色为阳性（2分）、棕褐色为强阳性（3分）；低倍镜下评估细胞阳性染色百分比：0%～1%为 0分，1%～10%为 1分，10%～50%为2分，50%～80%为3分，＞80%为4分。最终免疫组化染色得分=染色强度×阳性染色百分比。阴性0～4分，阳性 5～12 分。

1.2.3 SACC组织与癌旁正常组织SEMA3G基因启动子甲基化水平检测 采用qMSP法。所有组织标本取3～5张7 μm厚的连续石蜡切片，行HE染色，37℃烘箱中干燥过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，将上述切片置于光学显微镜下，用27G注射针头小心挑取SACC细胞和癌旁正常细胞（约3 000～5 000个），严格按照QIAampDNA抽提试剂盒（德国Qiagen公司）中提供的操作说明提取和纯化微量DNA。采用EpiTectDNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒（德国Qiagen公司），按照说明书中的操作步骤对DNA进行亚硫酸氢钠修饰及纯化。根据SEMA3G基因序列设计CpG岛特异性的甲基化和非甲基化引物，采用ABI 7500 PCR仪对亚硫酸氢钠法修饰的DNA进行qMSP分析。SEMA3G相关引物序列（生工生物有限公司）如下：SEMA3G（M）-F：5′-AATTATAATCGGCGGTTAGCGG-3′，SEMA3G（M）-R：5′-CCGCAAACGAAACACACTAAAAC-3′；SEMA3G（U）-F：5′-AATTATAATTGGTGGTTAGTGGGA TTAG-3′，SEMA3G（U）-R：5′-ACCACAAACAAAACACACTAA AACCA-3′。使用SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司）按操作步骤进行PCR反应。55例样本组织分别进行甲基化PCR扩增和非甲基化PCR扩增，根据所得的Ct值和标准曲线计算样本中DNA甲基化的相对百分比率，甲基化率计算公式：甲基化率（M%）=[甲基化DNA拷贝数（/甲基化DNA拷贝数+非甲基化DNA拷贝数）]×100%。M%＜20%：0分；20%～40%：1分；40%～60%：2分；60%～80%：3分；＞80%：4分。本研究将0分定义为无甲基化，其余归类于有甲基化，其中1～3分为部分甲基化，4分为完全甲基化。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SACC组织与癌旁正常组织SEMA3G表达水平比较 SEMA3G主要在细胞核中阳性表达，见图1（插页）。SACC组织与癌旁正常组织SEMA3G表达阳性率分别为43.64%（24/55）、96.36%（53/55），SEMA3G 在SACC组织中表达较在癌旁正常组织中明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05）。

图1 涎腺腺样囊性癌（SACC）组织与癌旁正常组织中信号素分子3G（SEMA3G）的表达（a、b：筛状型SACC组织阴性、阳性表达；c、d：腺管型SACC组织阴性、阳性表达；e、f：实体型SACC组织阴性、阳性表达；g、h：癌旁正常组织阴性、阳性表达；免疫组化染色，×400）

2.2 SACC组织与癌旁正常组织SEMA3G基因甲基化水平比较 SACC组织SEMA3G基因甲基化率为87.27%（48/55），其中完全甲基化率 49.10%（27/55），部分甲基化率38.18%（21/55）；癌旁正常组织SEMA3G基因甲基化率为9.09%（5/55），均为部分甲基化。SACC组织SEMA3G基因甲基化水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 SACC患者SACC组织SEMA3G表达水平、基因甲基化水平与临床病理特征的关系 T1～3级SACC患者SEMA3G表达水平高于T4级患者，而SEMA3G甲基化水平低于T4级患者（均P＜0.05）。TNM分期Ⅰ～Ⅲ期患者SEMA3G表达阳性水平高于Ⅳ期患者，而SEMA3G甲基化水平低于Ⅳ期患者（均P＜0.05）。无肌层浸润的SACC患者SEMA3G表达水平高于有肌层浸润患者（P＜0.05）。未复发的SACC患者SEMA3G表达水平高于复发SACC患者（P＜0.05）。SEMA3G基因甲基化水平与SACC患者T分级、TNM分期有关（均P＜0.05）。而不同性别、年龄、肿瘤位置、组织类型、是否侵犯邻近组织、淋巴结转移、神经累及、远处转移的SACC患者SACC组织SEMA3G表达水平及基因甲基化水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.4 SACC患者SACC组织SEMA3G表达水平与预后的关系 55例患者2例失访，随访5～145个月，中位随访时间56个月。SEMA3G表达阳性的24例患者中死亡4例，SEMA3G表达阴性的31例患者中死亡12例。不同SEMA3G表达水平的患者无进展生存期比较差异有统计学意义（P＜0.05），生存曲线见图2。

3 讨论

图2 信号素分子3G（SEMA3G）阳性表达与阴性表达患者生存曲线比较

SACC是口腔颌面部较常见的恶性肿瘤，具有血管浸润性及神经侵袭性，常导致肿瘤浸润范围较广，手术不能完全切除，预后较差，即使术后合并放化疗等综合治疗效果仍不令人满意[1]。近些年临床研究者致力于筛选与SACC发生、发展相关的生物标志物，希望为更好地筛选、诊断及治疗SACC提供思路。信号素家族成员是一类高度保守的分泌型或跨膜型糖蛋白，其与肿瘤的发生、发展密切相关。SEMA3G通过与NRP-2受体和Plexin受体结合形成复合体，介导下游的信号转导，对肿瘤细胞生长、血管形成有不同程度的抑制作用[13]。相关研究显示SEMA3G能够明显抑制胰腺癌的增殖、侵袭和转移；将稳定表达SEMA3G的乳腺癌细胞株MDA-MB-435接种到裸鼠体内发现肿瘤生长体积及重量受到了明显抑制；将其转染至MDA-MB-231细胞系中肿瘤抑制依然存在，同时发现SEMA3G对该肿瘤的血管形成也具有明显的抑制作用[11-15]。SEMA3G高表达可以抑制黑色素瘤的生长及血管形成[13]；SEMA3G的表达下调可导致VEGF相关的恶性间皮瘤中血管生成和肿瘤生长抑制活动的丧失[11]。同时SEMA3G也可抑制U251胶质瘤细胞的增殖，可通过抑制基质金属蛋白酶（MMP）-2的表达，从而减弱神经胶质瘤细胞侵袭和迁移能力，发挥抑癌基因的作用[15]，人脑胶质瘤中SEMA3G的表达水平同患者预后生存期存在相关性，SEMA3G可以作为脑胶质瘤的一个预后评估指标[12,15]。本研究结果显示43.64% SACC组织中SEMA3G表达阳性，远远低于SEMA3G在癌旁正常对照组织中的表达阳性率，其中T4级及TNM分期Ⅳ期SACC组织中SEMA3G表达水平明显低于T1～3分级及Ⅰ～Ⅲ分期SACC组织；有肌层浸润及复发的SACC组织中SEMA3G表达水平明显低于无肌层浸润及无复发的组织；而SEMA3G表达水平与SACC患者的性别、年龄、肿瘤位置、组织类型、有无侵犯邻近组织、淋巴结转移、神经累及、肌层浸润及远处转移无明显关系。Kaplan-Meier分析显示，SEMA3G表达阴性患者预后较差。上述结果提示SEMA3G表达阴性可能是SACC疾病进展过程中的危险因素，SEMA3G基因在SACC发生、发展中发挥抑癌基因的作用。

表1 SACC患者SACC组织SEMA3G表达水平、基因甲基化水平与临床病理特征的关系[例（%）]

表观遗传学中DNA甲基化与人类常见的恶性肿瘤发生、发展关系密切，抑癌基因启动子区异常高甲基化可导致其转录失活，从而促进肿瘤的发生、发展[3]。本研究采用了qMSP法检测了55例SACC组织和配对癌旁正常组织中SEMA3G基因启动子区甲基化情况，结果显示87.27%的SACC组织中存在SEMA3G基因启动子5′-CpG岛甲基化，其中完全甲基化水平达49.10%；而癌旁正常组织甲基化水平仅为9.09%，提示DNA甲基化可能是SEMA3G在SACC组织中低表达的原因之一。与临床病理特征的关系分析表明，T4分级及TNMⅣ期SACC组织中SEMA3G甲基化水平达100%，相比于T1-3分级及TNM分期Ⅰ～Ⅲ期组织，差异有统计学意义，而SEMA3G基因甲基化水平与SACC患者的性别、年龄、肿瘤位置、组织类型、有无侵犯邻近组织、淋巴结转移、神经累及、肌层浸润、远处转移及复发无明显关系。本研究初步评估了SEMA3G基因在SACC组织中的甲基化水平，后续笔者将在SACC细胞中检测SEMA3G的甲基化水平及5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理后的去甲基化状态下SEMA3G的表达水平，并完善相关细胞功能实验。

综上所述，SEMA3G基因启动子区高甲基化可能是其在SACC组织中表达下调的原因之一，并参与了SACC的发生与预后，但SEMA3G在SACC中的具体分子机制尚需进一步深入研究，SEMA3G在SACC诊断和预后评估中的价值仍需更多大样本临床实验验证。