塑料袋混合营养培养小球藻技术

小球藻是第一个被人工培养的微藻，它可作为人类的食品及食品添加剂，也可作为水产动物人工育苗阶段的饵料和饲料添加剂，还可作为培养轮虫的饵料以及用于提取EPA、DHA、类胡萝卜素、虾青素等。此外，小球藻可用于调节水质。

小球藻大规模培养研究可以分为两个阶段，1950－1979年主要进行开放水池培养的研究，1980年开始进行密闭和半密闭反应器培养的研究。传统的产业化微藻培养多利用开放的水池，微藻以光合自养的模式生长。而采用透明容器或玻璃管道设计的半密闭和密闭光照生物反应器培养系统进行培养，藻类细胞的密度提高了6～12 倍，总体积相对减少，分离成本大大降低；各种生长因子及工艺可以采用自动化、集约化管理，提高了生产效率和产品质量，可以避免受到其他生物和非生物的污染，但存在光反应器一次性投资大、许多技术尚未完全解决的问题。近年来，小球藻的高密度异养发酵培养技术也取得了巨大的进步，大幅度提高了小球藻的生长速度，使小球藻异养培养的工业化生产成为可能，然而其存在异养代谢过程同自养代谢或混养代谢有很大差异、对设备要求高、投资大等不足之处，普通水产养殖企业不愿意高投资进行小球藻生产，而且设备的操作流程比较复杂和难以掌握。

针对现有技术中存在的问题，本技术利用小球藻可以进行混合营养培养的特点，结合传统的塑料袋培养方法，进行简化和优化，通过提供混合营养生长所需的营养物质和条件，改变小球藻传统培养中仅进行光合自养或异养的代谢方式，形成了利用塑料袋进行小球藻混合营养培养技术。采用该技术培养小球藻，可有效提高藻类的培养效率，减少对设备的依赖和能源的消耗，从而缩减小球藻培养的成本，便于推广应用。

一、材料与方法

1.培养容器的选择及前处理 选用容积为20～100升的透明塑料袋作为培养容器，培养容器在使用前用漂白粉溶液浸泡24小时后曝晒12小时备用；塑料袋可采用藻类培养专用塑料袋，也可采用虾苗或鱼苗运输用袋。

2.培养液的配制 培养液由基础培养基、葡萄糖、水组成。基础培养基可选用BG11 培养基、f/2培养基或复合肥培养基，其中BG11和f/2为常用的藻类培养基，复合肥为俄罗斯阿康复合肥(N∶P∶K＝16∶16∶16)。葡萄糖的添加量为每升培养液中用0.5～1 克，这样可为小球藻提供异养生长的条件，使小球藻在自然条件下有无光照均能生长，同时也可弥补单纯使用无机营养盐培养小球藻导致的营养不均衡缺陷。

3.培养种类及接种 培养种类为普通小球藻。接种进培养容器中的藻类为正处于指数生长期的小球藻，将处理后的培养容器装培养液至容积的50%，培养容器内装入培养液后于9:00－11:00 进行小球藻接种。接种的小球藻藻液的温度与培养液的温度基本保持一致，接种量为培养总量的10%左右，接种完成后培养容器密封于10℃以上的温度条件下进行混合营养培养。密封时，藻类培养专用塑料袋用封口盖密封，虾苗、鱼苗尼龙袋用橡皮圈打结封口。光照采用自然光照，在气温较低时最好将培养容器放置在玻璃阳光房或塑料大棚内进行培养。

4.日常管理 接种完成后，将培养容器整齐摆放在有白色瓷砖的地面上，每天摇动培养容器至少4次，观察培养容器内藻类的生长情况，并用紫外分光光度计测量藻液的光密度(OD)值。通常在接种的第2天开始，塑料袋内溶液色泽稍微变浓且有小气泡产生，表明小球藻生长正常；接种后两天若袋内颜色没有变化或无气泡产生，且颜色灰黄，表明接种失败，应及时放弃、清理。当培养容器内的藻液变得浓绿时即可接种到其他藻类培养容器内，接种方法与上述方法相同。在留够足量藻种的情况下，可将培养的藻类用于轮虫、枝角类和鱼苗或虾苗的培育。使用过的培养容器及塑料袋在保证没有破损的前提下，经漂白粉溶液消毒后方可用于下一次的培养。

二、结果

1. 20 升的平面藻类培养袋培养 在容积为20 升的平面藻类培养袋中使用BG11 作为藻类基础培养基，添加葡萄糖量为1 克/升，进行小球藻培养，接种量为10%，培养体积为10升，接种后的初始OD 值为0.091，培养4 天后藻类OD 值为1.201，细胞密度为1 835.24 万个/毫升，细胞干重为0.25 毫克/毫升。使用f/2 作为藻类基础培养基，添加葡萄糖1 克/升，进行小球藻培养，接种量为10%，培养体积为10 升，接种后的初始OD 值为0.091，培养4 天后藻类OD值为0.974，细胞 干 重 为0.20 毫 克/毫升，细胞密度为1 481.02 万个/毫升。使用复合肥培养基作为藻类基础培养基，复合肥添加量为1 克/升，再添加葡萄糖1 克/升，进行小球藻培养，接种量为10%，培养体积为10 升，接种后的初始OD 值为0.091，培养4 天后藻类OD 值为0.641，细胞密度为963.32 万个/毫升，细胞干重为0.14 毫克/毫升。

2. 40升的鱼苗尼龙袋培养 在容积为40升的鱼苗尼龙袋中使用复合肥培养基作为藻类基础培养基，复合肥添加量为1 克/升，再添加葡萄糖1克/升，进行小球藻培养，接种量为10%，培养体积为10升，接种后的初始OD值为0.092，培养5天藻类OD 值为0.601，细胞密度为901.04 万个/毫升，细胞干重为0.13毫克/毫升。

三、讨论

从具体培养的结果看，利用塑料袋进行小球藻混养营养培养是可行的，而采用不同的基础培养基以及采用不同的培养容器效果会有所区别。采用该技术培养小球藻，可有效提高小球藻的培养效率，以水池培养为对比，在水温20～29℃，培养至第4 天，小球藻密度为856 万个/毫升，而本方法培养至第4天最高(BG11作为基础培养基)可达1 835.24 万个/毫升，最少(复合肥作为基础培养基在尼龙袋中培养)也可达到901.04 万个/毫升。同时，因为培养过程中不需要充气、不需要额外提供光照和加温等，可减少对设备的依赖和能源的消耗，从而缩减了小球藻培养的成本，使得操作比较简单，更便于进行推广应用。