一氧化氮合酶、环氧合酶-2在不同类型胃食管反流病中的表达及意义

岳爱君,尹宇杰,李莹,天津市职业病防治院急诊内科 天津市 300011

0 引言

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)可分为非糜烂性胃食管反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)、Barrett食管(Barrett esophageal,BE)三种类型.有学者报道[1]GERD这三种类型转化少,独立性较强,预后有一定差异.随着临床对GERD病理生理机制研究的深入,其诊断准确性和治疗有效性已得到较大改善,但由于GERD病因多样,发病机制复杂,不同类型GERD病理学表现不尽相同,在GERD诊治方面仍需进一步加强.在GERD的诊断方面,RE、BE可通过胃镜、病理进行可靠诊断,但NERD在胃镜下并无食管损伤客观依据,主要靠临床症状进行辨别,难度较大.近来研究发现一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase,NOS)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)可能参与了GERD的发生发展[2,3].但关于NOS、COX-2在不同类型GERD中的表达报道较少,而关于NOS与COX-2关系的研究更是未见报道.基于此,本研究对不同类型GERD患者的NOS、COX-2的表达水平进行分析,旨在分析NOS、COX-2关系,并为临床不同类型GERD的诊治提供参考,现将研究结果报告如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料:前瞻性选取2015-01/2019-12我院内科收治的GERD患者78例作为观察组,男43例,女35例,年龄26-72岁,平均年龄49.24岁±11.56岁.按照GERD不同类型分为NERD、RE、及BE 3组.

1.1.2 纳入标准:纳入标准:(1)符合中华医学会消化病学分会制定的《2014年中国胃食管反流病专家共识意见》[4]中关于GERD的诊断标准,经食管pH监测和病理学检查确诊；(2)患者自愿参与研究,并签署知情同意书；(3)无腹部手术史；(4)无幽门螺杆菌感染.

1.1.3 排除标准:排除标准:(1)恶性肿瘤等严重器质性病变者；(2)消化道出血或消化性溃疡等其他消化性疾病者；(3)糖尿病等严重全身性代谢疾病者；(4)1 wk内呼吸道感染史或肺部感染史者.另选取同期在本院门急诊及体检中心进行胃镜检查的26例健康人群作为对照组.

1.2 方法

1.2.1 内镜检查:检查前14 d停止抑制胃酸分泌及抑制NOS分泌等GERD治疗药物,检查前12 h常规禁食禁水.对所有纳入对象应用电子内镜(日本Olympus公司,GIF-Q240型)进行检查,观察并记录胃内组织病理表现,并根据不同类型进行分组.内镜下表现为RE、BE者,于病变部位进行活检,留取1-2块活检组织；内镜下表现为NERD者或正常对照组成员,则于食管远端鳞状上皮与柱状上皮交界处上方2 cm处取活检组织1-2块.将取得的标本迅速置于-80℃的液氮中冷藏待检.

节水增粮行动项目规模化建设高效节水灌溉工程，覆盖范围广、资金投入大，涉及农民切身利益，能否长期运行发挥效益关系经济发展和社会稳定，因此项目建设过程必须要严格管控、建管并重，尤其是项目后期运行维护要严抓不怠。项目实施过程要加强督查指导，完善管理措施，确保工程质量；建成运行后要进一步完善工程运行管护机制，落实运行维护经费来源，配备专职人员对地下水水井、输水管线、微灌设施和电气化设备进行定期保养、维护和更新，保障节水增粮行动工程建设规范、使用便捷、管护得当、长期受益。

1.2.2 实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测NOS mRNA及COX-2 mRNA的表达:(1)总RNA提取:取液氮速冻标本,研磨裂解后,利用Trizol试剂盒提取总RNA,并采用紫外分光光度计(Alpha1型,上海谱元仪器有限公司)测定RNA纯度,吸光度(A)比值A260/A280≥1.8提示RNA提取成功；(2)mRNA逆转录为cDNA:利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA；(3)qRT-PCR扩增:以反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增,以GAPDH基因作为内参照,NOS引物序列由上海生物工程技术公司合成,参照NCBI GenBank提供的人类基因序列进行设计.COX-2、GAPDH引物序列见表1.PCR反应条件:94℃预变性60 s,92℃变性30 s,56℃退火30 s,74℃延伸30 s,重复38个循环.利用用 2-△△Ct法对组织中NOS mRNA及COX-2 mRNA相对表达量进行计算,检测中所采用的引物、Trizol试剂盒均有上海生物工程技术公司提供,其余试剂由北京奥科生物技术有限公司,试剂盒检测时严格按照试剂盒说明书进行.

统计学处理采用统计软件SPSS 22.0处理数据,计数资料行χ2检验；计量资料用(mean±SD)表示,行单因素分析,进一步两两比较采用SNK检验；相关性分析采用Person检验；指标的检测价值采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线进行分析.P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 各组一般资料比较 内镜及组织病理学检查显示,78例GERD患者中,RE组26例、NERD组28例、BE组24例；各组患者在性别年龄等一般资料比较无显著差异(P＞0.05),具可比性(表2).

2.2 各组患者NOS mRNA、COX-2 mRNA表达水平比较 3种不同类型GERD的NOS mRNA[神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS) mRNA、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA]、COX-2 mRNA表达水平明显高于对照组(图1和2),且BE组NOS mRNA、COX-2 mRNA表达水平明显高于RE组,RE组NOS mRNA、COX-2 mRNA表达水平明显高于NERD组,差异均有统计学意义(P＜0.05).详见表3.

2.3 NOS mRNA与COX-2 mRNA的相关性分析 nNOS mRNA、iNOS mRNA与COX-2 mRNA均呈显著正相关(r=0.900、0.897,P＜0.05).见图3和4.

2.4 nNOS mRNA、iNOS mRNA与COX-2 mRNA表达水平对NERD的诊断 ROC曲线分析显示,nNOS mRNA诊断NERD的AUC为0.662,iNOS mRNA诊断NERD的AUC为0.671,COX-2 mRNA诊断NERD的AUC为0.613；Z检验AUC发现差异无统计学意义(P＞0.05),根据最佳临界值,当nNOS mRNA高于1.505时,其敏感度为65.8%,特异度为89.3%；当iNOS mRNA高于1.795 时,其敏感度为63.2%,特异度为100%；当COX-2 mRNA高于1.895时,其敏感度为55.3%,特异度为92.9%.见表4和图5.

表1 实时荧光定量PCR引物序列

表2 各组一般资料比较(n,mean±SD)

图1 不同类型胃食管反流病中一氧化氮合酶的表达.nNOS：神经元型一氧化氮合酶；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；NERD：非糜烂性胃食管反流病；RE：反流性食管炎；BE：Barrett食管.

3 讨论

图2 不同类型胃食管反流病中环氧合酶-2的表达.COX-2：环氧合酶-2；NERD：非糜烂性胃食管反流病；RE：反流性食管炎；BE：Barrett食管.

近年来GERD发病率呈上升趋势,不但会引起胃灼热、胸痛、反酸、吞咽疼痛等消化系统损害,而且还可累及呼吸系统,其中BE还可进展为食管腺癌,严重危害患者生命健康.目前,GERD的发生机制仍存在争议,以往观点认为GERD是由胃内容物反流入食管,使食管腔过度接触胃液引起食管粘膜损伤导致的.但在动物实验研究中,该观点并未获得证实,且临床上有50%以上的GERD为NERD,内镜下并不表现出食管粘膜损伤[5,6].越来越多报道显示,炎性介质介导的食管上皮炎性反应是导致GERD的主要病因,并且与食管下括约肌(low esophageal sphincter,LES)功能失调、并发食管裂孔疝及食管动力障碍等有关[7-9].

表3 各组患者一氧化氮合酶mRNA、环氧合酶-2mRNA表达水平比较(mean±SD)

表4 神经元型一氧化氮合酶mRNA、诱导型一氧化氮合酶mRNA与环氧合酶-2 mRNA水平诊断非糜烂性胃食管反流病的受试者工作特征结果

图3 神经元型一氧化氮合酶mRNA与环氧合酶-2mRNA的相关性分析.nNOS：神经元型一氧化氮合酶；COX-2：环氧合酶-2.

图4 诱导型一氧化氮合酶mRNA与环氧合酶-2 mRNA的相关性.iNOS：诱导型一氧化氮合酶；COX-2：环氧合酶-2.

图5 神经元型一氧化氮合酶mRNA、诱导型一氧化氮合酶mRNA与环氧合酶-2 mRNA水平诊断非糜烂性胃食管反流病的受试者工作特征曲线. nNOS：神经元型一氧化氮合酶；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；COX-2：环氧合酶-2；ROC：受试者工作特征.

NOS是介导NO生成的酶,NO为肠神经系统非胆碱能神经、非肾上腺素能的主要抑制性神经递质,可调节LES功能和食管动力[10].但NO半衰期非常短,测量难度较大,因此本研究以NOS水平来反映NO水平.NOS根据其活性可分为诱导型(induced NOS,iNOS)和基本型(construction NOS,cNOS),而cNOS又可分为神经元型NOS (neuron NOS,nNOS)和内皮细胞型NOS (endothelial cell,eNOS).因食管兴奋主要受神经元支配,尤以LES神经支配中的抑制性运动神经元为主,故在本研究中在cNOS的选择中将nNOS纳入研究指标.本研究中,3种不同类型GERD的NOS mRNA (nNOS mRNA、iNOS mRNA)表达水平显著高于对照组,且BE组NOS mRNA表达水平显著高于RE组,RE组NOS mRNA表达水平显著高于NERD组.提示nNOS、iNOS可能共同调节LES神经支配的抑制性运动神经元,引起食管平滑肌功能障碍,从而加重GERD.笔者认为其原因为NOS高表达可引起NO含量升高,而NO可调节食管括约肌张力,NO含量升高可引起括约肌松弛[11].RE胃食管粘膜损伤较NERD严重,出现糜烂症状,因此NOS表达水平较高,而BE患者有些细胞开始大量增殖,病变严重,故NOS表达水平最高.

GERD的发生发展与炎性因子介导的炎症反应关系密切,特别是食管粘膜中的促炎性因子.COX-2是在炎性反应组织中高表达,而在正常组织中组织炎性反应低表达或不表达的一种蛋白,不仅是免疫白细胞的趋化因子,合成产物前列腺素E 2与组织炎性反应直接相关,而且可降低神经纤维的阈电位[12].杨梅[13]在不同类型胃食管反流病患者病变组织中COX-2表达与患者血清炎性因子水平关系研究中表示,COX-2与肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(interleukin,IL) -1β、IL-6、IL-8等促炎症因子呈显著正相关.本研究结果中,3种不同类型GERD的COX-2 mRNA表达水平显著高于对照组,且BE组COX-2 mRNA表达水平最高,RE组次之,NERD组最少,差异均有统计学意义,与上述研究结果一致.究其原因可能为COX-2定向趋化胃食管粘膜白细胞,诱导免疫系统细胞进入感染区域,并且可合成前列腺素E 2,发挥促炎作用,从而加重炎症组织损伤,导致细胞异常增殖[14,15].BE患者中COX-2表达水平最高,是因为BE组织病变较为严重,进一步可能发展为癌症,而COX-2高表达被认为早期癌变事件,因此BE患者中COX-2表达水平最高；RE与NERD的主要区别在是否出现胃食管粘膜糜烂,RE胃食管粘膜糜烂,炎症较为严重,故COX-2表达更高.

通过Person相关分析发现,NOS与COX-2表达呈显著正相关,提示NOS、COX-2可能共同参与了食管黏膜炎症反应和食管下括约肌功能的调节,协同促进食管黏膜损伤.NERD是最常见的GERD,但由于在胃镜下没有明确的食管损伤,故在诊断上有一定难度,笔者研究中发现在不同类型的GERD组织中,NOS与COX-2表达水平不同,因此推测NOS、COX-2对NERD的诊断有一定价值.本研究经过ROC曲线分析显示,nNOS mRNA诊断NERD的AUC为0.662,iNOS mRNA诊断NERD的AUC为0.671,COX-2 mRNA诊断NERD的AUC为0.613,提示NOS与COX-2对NERD的诊断有一定价值,但价值有限,可能通过联合诊断增强其诊断价值.

4 结论

综上所述,NOS、COX-2在不同类型GERD中均呈高表达,其中在BE患者中表达最高,RE患者中表达次之,NERD患者中表达最少,并且对NERD的诊断有一定参考价值.

文章亮点

实验背景

随着人民生活水平、饮食习惯、饮食结构的改变,胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)在临床较为常见,近年来发病率呈上升趋势,已严重影响到民众身心健康.GERD包括非糜烂性胃食管反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)、Barrett食管(barrett esophageal,BE)三种,其中RE、BE可通过胃镜、病理进行可靠诊断,但NERD食管损伤不明显,诊断有一定难度.已有研究表明,一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase,NOS)、环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2)在GERD发生发展中扮演重要角色,但在不同类型GERD方面报道较少,亟待完善与充实.

实验动机

NOS、COX-2与GERD有关已在诸多研究中被证实,但在不同类型GERD中的表达报道较少,现有的胃镜对NERD诊断效果较差,食管pH对NERD的分型也有难度.因此本研究分析NOS、COX-2在不同类型GERD中的表达,为NERD的早期诊断提供参考.

实验目标

探究NOS、COX-2在不同类型胃食管反流病中的表达及意义.

实验方法

选取行内镜检查的门诊及住院患者,并依据食管pH监测和病理学检查结果分为NERD组、RE组、及BE组；同时选取本院门急诊及体检中心进行内镜检查的26例健康人群作为对照组.分别比较各亚组NOS mRNA、COX-2 mRNA表达水平,资料采用SPSS 22.0处理.

实验结果

NOS、COX-2在不同类型GERD中均呈高表达,其中在BE患者中表达最高,RE患者中表达次之,NERD患者中表达最少,所有组间比较均存在显著差异,且NOS、COX-2呈显著正相关,提示NOS、COX-2相互促进,参与GERD进程,据此笔者进一步分析显示NOS、COX-2对NERD有一定诊断价值.

实验结论

NOS、COX-2对GERD的分型有参考价值,对提高临床GERD诊疗有一定意义.

展望前景

本研究不足之处在样本量较小,研究中心单一,且未对NOS、COX-2参与炎性反应的机制进行分析,仍需进行大样本量、多中心的试验,进一步明确GERD的发病机制.为新药的研究提供参考.