肝细胞癌缺氧微环境中低氧诱导因子-1α促进癌细胞免疫逃逸及治疗耐受的发生机制

杨焕珍,右江民族医学院研究生学院 广西壮族自治区百色市 533000

周喜汉, 右江民族医学院附属医院消化内科 广西壮族自治区百色市533000

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前癌症相关死亡率的第二大主要原因[1].作为炎症相关性肿瘤,HCC的发生发展中免疫耐受及免疫逃避机制发挥着重要作用.微脉管系统和免疫细胞是HCC肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的主要组成部分.HCC是实体瘤,癌组织内部容易形成缺氧TME,缺氧通过低氧诱导因子1-α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在TME中起关键作用,在低氧的基础上,HIF-1α调节肿瘤免疫TME从来不是单纯一条途径,而是由多条通路共同交织协同作用最终促进肿瘤的免疫重建,通过代谢重编程、转录因子、阻遏物以及细胞因子参与的免疫调节通路以及自噬来促进肿瘤细胞逃避免疫损害.目前HCC的免疫疗法取得了很大进步,但部分抗肿瘤药物可出现耐药性导致药效不佳.本文将系统的综述HCC缺氧TME中HIF-1α对免疫调控和治疗抗性的机制,为免疫治疗提供潜在的新靶点.

1 代谢重编程

在癌症中观察到的免疫逃逸的关键步骤之一是代谢竞争.在氧气充足及线粒体功能正常的情况下癌细胞进行有氧糖酵解,利用葡萄糖向丙酮酸转化并生成乳酸,此为Warburg效应.糖酵解效应比氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)更快,同时产生ATP速度相应增快,糖酵解能产生子代细胞所需的营养物质,如脂质,蛋白质或核酸,癌细胞更倾向于优先利用糖酵解,而非OXPHOS[2].有氧糖酵解是代谢重编程的主要特征,是癌症的标志之一.由于癌细胞增殖快,对ATP需求大大增高,糖酵解通量迅速提高,但OXPHOS通量保持不变.HIF-1α通过促进癌细胞的糖酵解来进一步调节免疫重编程,以促进癌细胞逃避免疫监视.

1.1 乳酸酸化 HIF-1α是糖酵解调控的上游信号.在缺氧TME中,HIF-1α可促进癌细胞的糖酵解,导致HCC细胞内产生大量的乳酸,并通过HIF-1α驱动的MCT4受体驱使细胞内的乳酸排放至TME中,导致pH下降,T淋巴细胞内的乳酸积累并排放受阻.若短时间乳酸积累则抑制T细胞的增殖和功能,促炎性细胞因子[如白细胞介素(interleukin,IL) -2、IL-12]分泌减少,降低颗粒酶B和穿孔素的表达从而抑制自然杀伤细胞(natural killer,NK)细胞的功能并诱导效应T细胞凋亡；细胞内乳酸长时间(≥24 h)积累,则超过60%T细胞凋亡[但调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)不受乳酸酸化的损害][3].HIF-1α促进肿瘤相关巨噬细胞向M2极化随后释放IL-10抑制性细胞因子,促进肿瘤血管生长及抑制NK细胞的毒性作用,乳酸还可促进肿瘤相关M2巨噬细胞和辅助性T细胞的生长,有研究表明,乳酸诱导M2巨噬细胞中精氨酸酶1 (enzyme arginase 1,Arg1)和诱导型一氧化氮合酶的表达,以提高免疫抑制功能[4].

此外,乳酸激活mTOR信号传导,致使某些抗肿瘤治疗药物产生耐药性.因此,在肿瘤缺氧TME中,HIF-1α增强无氧糖酵解从而产生更多的乳酸,以协助癌细胞躲避免疫细胞的攻击进行免疫逃逸.另外,酸性微环境和碱性胞质溶胶在癌细胞质膜上产生质子梯度(酸梯度)来代表质子动能,刺激了肿瘤的增殖,在不存在糖酵解和线粒体ATP合成的情况下,癌细胞利用酸梯度,从磷酸盐中合成大量的磷酸盐键[5].这些发现揭示了酸性肿瘤环境作为潜在能源和抗免疫的作用,并可能提供新的治疗靶点,值得进一步研究.

1.2 营养掠夺 癌细胞与免疫细胞共同处于HCC缺氧TME中,导致两者之间存在营养物质的竞争.癌细胞自身增殖速度快,缺氧TME依赖HIF-1α的无氧糖酵解,1个葡萄糖仅生成2个ATP分子,致使癌细胞在TME中吸收养分能力大大增加,葡萄糖、氨基酸(如丝氨酸、色氨酸)等营养物质被癌细胞消耗,肿瘤微血管供应不足,以免疫细胞生长减缓为代价掠夺营养,导致免疫细胞功能下降.癌细胞在TME中的代谢不仅提供能量支持,也提供抗免疫力.

1.2.1 葡萄糖摄取:缺氧时HIF-1α可激活PI3K/AKT/mTOR途径和癌细胞多种糖酵解关键酶(己糖激酶、磷酸果糖激酶)的活性,引起糖酵解通量增加,抑制AMPK信号传导,促进cMyc驱动葡萄糖转运蛋白GLUT-1、GLUT-3的表达[2],以提高葡萄糖摄取能力；此外,HIF-1以乳酸脱氢酶-A、丙酮酸脱氢酶激酶为靶标,使OXPHOS切换到糖酵解,剥夺效应T细胞营养.效应T细胞依靠糖酵解进行高能量代谢,Treg细胞则相反,Treg细胞在激活后就同时依赖脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)和OXPHOS来获得ATP[6],这种代谢状态允许Treg细胞与肿瘤细胞共存并发挥免疫抑制效应,效应T细胞由于缺乏葡萄糖导致糖酵解通量下降,竞争摄取葡萄糖能力进一步下降.同时,Treg细胞还反过来抑制肿瘤区域的效应T细胞的反应来协调TME[7],效应T细胞的作用被多重抑制.另外,HIF-1α可调节T细胞的糖酵解活性,幼稚T淋巴细胞依靠糖酵解来重新编码活化T淋巴细胞的代谢,满足细胞增殖和分化成功能亚群的需求,以确定免疫反应的性质[8].总之,HIF-1α通过增强癌细胞葡萄糖摄取从而抑制效应T细胞的生长代谢,从而减弱其免疫力,促进肿瘤细胞的生长.

1.2.2 氨基酸代谢:肿瘤缺氧TME中氨基酸被HCC细胞大量消耗,免疫细胞蛋白质合成减少,导致营养感应机制GCN2激活,应激信号增强并引发自噬,同时免疫失衡,CD4+T细胞从TH17分化为Treg,影响TH17和Treg的比例,效应T细胞毒性减弱,从而抑制癌细胞裂解.

谷氨酰胺代谢,谷氨酰胺是蛋白质和脂质生物合成的前体.HIF-1α驱动的下游因子氨是由于肿瘤细胞的谷氨酰胺分解上调所致癌细胞对谷氨酰胺的代谢增强,削弱了活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)相关途径[9],调节各类免疫细胞的数量和功能,包括诱导未成熟树状突细胞(dendritic cells,DC)细胞的产生,嗜中性粒细胞和成熟DC细胞数减少,DC细胞吞噬能力下降,抗肿瘤特异性T细胞抗原提呈能力下降,同时诱导M2巨噬细胞极化等,最终抗肿瘤免疫作用减弱.在缺乏谷氨酰胺的TME中激活T细胞会导致它们分化为Foxp3(+)Treg,从而抑制T细胞活性.Fu等[10]认为,IL-23应被视为透明细胞肾细胞癌中的治疗靶标,该肿瘤细胞的谷氨酰胺消耗导致局部剥夺细胞外谷氨酰胺,其通过HIF-1α的激活诱导肿瘤相关巨噬细胞分泌IL-23,以激活调节性T细胞增殖并促进IL-10和转化生长因子β表达,从而抑制细胞毒性淋巴细胞杀死肿瘤细胞.而在HCC中,IL-23通过信号通路(如TLR4/MyD88信号通路[11]、NFκB/p65信号通路[12]等)促进HCC细胞的转移.相关证据表明[12-14],IL-23可在受到刺激后启动IL-17产生,并通过促进淋巴细胞凋亡及微血管生成以协助HCC进行免疫逃逸；IL-23及IL-17可能是HCC患者潜在治疗靶标,但仍需研究来进一步支持其与HCC细胞免疫调控方面的相互影响.谷氨酰胺在营养支持、抗免疫力方面促进了癌细胞的发生发展.

色氨酸代谢,人们在兔子中发现吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)能够代谢色氨酸[15],IDO可在肿瘤细胞及肿瘤相关细胞(如DC细胞、巨噬细胞、内皮细胞)中高度表达.在表达CTLA-4的Treg细胞与淋巴样DC细胞上的B7家族受体结合后可诱导淋巴样DC细胞表达IDO,免疫抑制分子干扰素-γ、转化生长因子(transforming growth factor,TGF) -β等也可诱导其表达IDO.IDO在多种肿瘤发生水平上起作用,肿瘤转移、免疫逃逸、侵袭和微血管生成等均与其参与炎症反应有关.IDO可催化犬尿氨酸途径中色氨酸分解代谢的第一步(色氨酸-N-甲酰基-犬尿氨酸的分解代谢过程)[16].T细胞在其TME中对色氨酸浓度的变化非常敏感,肿瘤细胞过度表达IDO剥夺TME中的色氨酸,导致T细胞功能降低,阻止效应T细胞增殖并诱导其凋亡,同时诱导Treg细胞分化,减弱抗肿瘤反应.色氨酸剥夺还诱导T细胞抗原依赖性,TCR的下调,抑制TCR通过MAPK途径下游信号传导所需的因子以及激活自噬,抑制哺乳动物雷帕霉素靶标和蛋白激酶C的作用[17].在T细胞浸润的肿瘤中,多种免疫抑制机制可通过Trp-Kyn-Ahr途径介导[18],引起色氨酸的消耗、直接免疫抑制以及激活Ahr来提高肿瘤免疫抗性,但目前该途径应用于HCC患者的免疫抑制机制的研究相对较少.色氨酸代谢是癌细胞代谢重编程的重要环节,抑制色氨酸代谢可以有效的阻止癌细胞的生长.

精氨酸代谢,精氨酸(arginine,Arg)是T细胞生存和活化以及记忆T细胞形成的关键营养素,Arg1将Arg分解为尿素和鸟氨酸.在TME中具有高水平的Arg1在T细胞中可显示出Arg下调,并增加Arg饥饿敏感性,导致T细胞抗肿瘤活性降低.精氨酸缺乏还可导致MDSCs的积累,从而使抗肿瘤T细胞反应减弱[19].此外,精氨酸生成的鸟氨酸是多胺的主要底物,是细胞周期进程中所需的原料,肿瘤细胞以此方式来储存Arg.精氨酸琥珀酸合成酶1 (arginine succinate synthase 1,ASS1)是催化Arg生物合成的限速酶,HIF-1α的下调可导致ASS1沉默,引起Arg饥饿的敏感性增加[20],导致肿瘤细胞的营养不足.相反,缺氧中HIF-1α的上调提高ASS1表达,其与Arg饥饿治疗肿瘤的抗性相关.Arg饥饿疗法有效的治疗肿瘤,逐渐受到人们了关注.

总体而言,TME中氨基酸代谢的变化对抗肿瘤免疫具有深远的影响.

1.3 腺苷的积累 缺氧限制能量供应主要通过降低TME中的ATP水平以及促进腺苷(adenosine,ADO)的积累,该过程是通过胞外核苷酸CD39和CD73对ATP的顺序分解而发生的.CD39将ATP和ADP水解为AMP,随后CD73将AMP水解为ADO.T细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞以及嗜中性粒细胞表面存在ADO的A2A受体(A2A receptor,A2AR),细胞外ADO通过与A2AR结合导致细胞死亡或无反应.因此,缺氧-A2AR-腺苷能引起免疫抑制,通过抑制肿瘤相关细胞的抗肿瘤作用来预防肿瘤排斥,这种抑制途径是由于缺氧-HIF-α介导的肿瘤细胞上MHC I类分子的缺失而掩盖肿瘤,Hatfield等[21]也认同此观点；值得注意的是,作为CD39家族的一种外切核苷酸酶,CD39L1的过度表达被认为是HCC的不良预后指标,HIF-1α通过上调的CD39L1表达促进ATP转化为AMP[22],从而阻止了MDSC的分化,并促进该细胞在肿瘤组织中的积累；Zhang等[23]证明了HIF-1a通过上调肿瘤宿主中Rab27a的表达,B细胞中表现出高水平CD39和CD73的细胞外囊泡增多,促进ATP和AMP水解并抑制CD8+T细胞增殖,免疫抑制作用及化学治疗效应减弱.此外,化学疗法本身可诱导肿瘤细胞大量释放ATP,释放的ATP被CD39和CD73水解为腺苷,削弱了抗肿瘤T细胞反应,因而产生治疗抗性.同时,CD73阳性也是HCC总体生存不良和无复发生存的统计学显著预测指标[24],揭示了CD39、CD73和ADO途径将成为HCC治疗的潜在靶标.

2 免疫抑制分子及信号传导通路

2.1 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种血管生成刺激剂,它通过抑制免疫细胞的成熟来抑制肿瘤免疫力,并诱导免疫抑制细胞,例如Treg细胞、肿瘤相关的巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞等.靶向VEGF/VEGF受体(VEGF receptor,VEGFR)的癌症治疗方法不仅具有抗血管生成作用,而且还具有免疫支持.由于肿瘤组织缺氧TME使肿瘤细胞稳定表达HIF-1α,并上调VEGF,促进微血管生成后为癌细胞提供氧气和养分,促使癌细胞增殖并随微血管远处侵袭转移,逃避免疫监视.在HCC组织中的HIF-1α和赖氨酰氧化酶样蛋白2 (lysyl oxidase-like 2 protein,LOXL2,主要催化细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的交联,促进肿瘤的侵袭和转移)之间存在正相关[25],HIF-1α通过调节LOXL2诱导上皮-间质转变,HCC细胞迁移,侵袭以及血管生成拟态的形成.而在缺氧期间,HIF-1α通过与缺氧反应元件直接结合后转录直接激活LOXL2,同时上调TGF-β间接诱导LOXL2来促进HCC的体内转移[26].LOXL2不仅自身促进肿瘤血管生成,而且还促进VEGFA表达,引起血管生成和肿瘤生长[27].虽然HIF-1α与LOXL2、LOXL2与VEGFA之间有相关性,但未有研究阐明在缺氧环境下通过HIF-1α/LOXL2/VEGFA途径发挥肿瘤血管新生及转移作用.

依赖HIF-1α的VEGF促进CSF-1、CXCL2分泌发挥趋化因子功能,以招募Tregs、M2极化巨噬细胞及MDSC浸润肿瘤TME.据报道[28],招募肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associated macrophages,TAMs)浸润肿瘤TME后,TAMs表面受体Nrp-1又被缺氧所抑制,导致TAMs在肿瘤内部不断积累.VEGF还可通过抑制DCs细胞的成熟并降低其抗原提呈功能,同时促进肿瘤细胞分泌免疫抑制分子TGF-β,发挥免疫抑制作用.肿瘤衍生的VEGF、IL-10和前列腺素E3协同诱导内皮细胞Fas配体表达,导致CTL耗尽,但不引起Treg耗竭[29].此外MDSCs能产生高水平的基质金属蛋白酶9,从细胞外基质中释放VEGF,VEGF以依赖VEGFR方式使CD8+CTL和Tregs上的靶向程序性细胞死亡受体-1 (programmed death 1,PD-1),同时肿瘤细胞上的靶向程序性细胞死亡受体-配体1 (programmed death-ligand 1,PD-L1)暴露出来并被上调,PD-1与PD-L1相结合,促使Treg细胞数量增多,相反的是,负性调节CD8+T细胞,CD8+T细胞的数量和功能受损,肿瘤细胞对CD8+T细胞介导的攻击产生抗性.此外,根据TME的不同,依赖HIF-1α的VEGF可改变免疫细胞的表型,在缺氧TME中,促进炎症反应的M1巨噬细胞向具有免疫抑制性M2巨噬细胞转变,未成熟髓样细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)向TAM迁移和分化.在缺氧TME中,VEGF不仅促进肿瘤新生血管,还能促进肿瘤相关免疫细胞的生长,多方面协助肿瘤抗击机体免疫.

2.2 环氧合酶途径 在HCC缺氧TME中,HIF-1α通过环氧合酶(cyclooxygenase,COX)途径调控免疫的分子机制尚不清楚,关于这方面的研究尚缺乏系统的阐述.COX作为免疫介质,由COX-1和COX-2两个子单元组成.COX是前列腺素合成的关键酶,HIF-1α在诱导肿瘤细胞表达COX2后,引起前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)增高,PGE2是一种炎症介质,在感染过程中会影响免疫细胞的活化,并与细胞因子协同促炎反应.在癌症中,PGE2能引起效应T细胞的腺苷/cAMP信号传导增强,导致Treg细胞增殖,DC细胞成熟障碍引发肿瘤细胞免疫逃逸.越来越多研究表明,COX-2不仅促进肿瘤血管生成,还帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸.

首先,COX-2促进肿瘤血管生成.缺氧/HIF-1α引起Warburg效应的上调可增加脂质合成,从而上调花生四烯酸和COX2的表达.Huang等[30]证明,经肝动脉化学栓塞术(transarterial chemoembolization,TACE)后HCC患者肿瘤标本,在缺氧基础上,行TACE术后缺氧进一步加重,HIF-1α刺激HCC癌细胞中COX-2蛋白的表达并促进上皮间质转化进程,从而促进瘤内血管生成,增强侵袭和转移.近年来,人们发现,阿片类药物作为癌症患者有效止痛药的同时还促进肿瘤的生长与转移.在乳腺癌,Schoos等[31]发现其中的机制之一,是癌细胞中的δ-阿片受体可激活HIF-1α诱导乳腺癌细胞中COX-2的表达,并通过旁分泌激活PGE2受体触发血管内皮细胞活化,驱动肿瘤血管生成.另一方面,COX-2阻滞剂塞来昔布介导HCC的血管生成和肿瘤生长抑制作用,也涉及到HIF-1α/COX-2这一信号通路[32],证明了依赖HIF-1α的COX-2可以促进肿瘤血管生成.

其次,COX-2帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸.依赖COX的细胞促进巨噬细胞表达TNF-α,通过HIF-1α/COX/TNF巨噬细胞轴来调控免疫[33].非酒精性脂肪性肝炎引发的人类HCC,由于肥胖导致在肝星状细胞中检测到COX2过表达和过量的PGE2产生,COX2介导的PGE2产生通过PTGER4受体从而抑制抗肿瘤免疫[34],文中尚未证明COX2和PGE2的过度表达是否与HIF-1α的介导有关,但是HIF-1α途径相关的代谢变化可能促进COX-2诱导HCC细胞凋亡抗性[35],且Warburg效应的上调引起肿瘤细胞脂质代谢导致花生四烯酸和COX2表达增高,由此我们猜测,由于缺氧TME中HIF-1α表达增高引起Warburg效应的上调从而导致COX的过度表达继而引发肿瘤细胞一系列抗免疫活动,这仍需进一步证明.而在骨再生缺氧TME中,证明了HIF-1α激活TNF-α的表达,该过程通过控制COX2来介导[36].另外,在使用COX2抑制剂或PGE2受体拮抗剂破坏COX2/PGE2信号,并结合抗PD-1阻断后,有效的阻止肿瘤存活和增加功能性肿瘤特异性CTL的数量[37].在一项体外试验中,通过CoCl2处理的食管鳞状细胞癌细胞可显着诱导COX-2和PD-L1表达,但可通过HIF-1α敲除或HIF-1α抑制剂PX-478处理来抑制[38],说明HIF-1α可以介导COX-2和PD-L1的表达,事实上,COX-2与PD-L1之间也存在潜在的相关性[39],COX-2很可能通过PD-L1的表达来增强免疫抑制作用,但具体的机制还需更深入的研究.总之,HIF-1α/COX2/PGE2通路可能是导致抗肿瘤治疗疗效产生抗性的因素之一,阻断此通路是一种有希望的辅助疗法.但是,HIF-1α诱导COX2表达对HCC进行免疫调控的研究需更深一步探索.

2.3 芳香烃受体信号传导途径 芳基烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)一类配体激活转录因子,在细胞核中AHR与AHR核转运子(AHR nuclear translocator,ARNT,也称为HIF-1β)结合共同控制靶基因的表达,而HIF-1α也与ARNT聚合形成HIF-1复合物,ARNT既作为HIF-1α所需的转录因子异二聚体伴侣,也是AHR转录因子复合物的重要组成部分,这两个途径通过ARNT来进行串扰,HIF-1α信号通路的激活抑制AHR信号通路[40].越来越多证据表明,缺氧途径干扰了AHR信号传导,并可能改变细胞稳态和功能.Wolff等[41]认为,在稳定缺氧TME中,ARNT蛋白水平受HIF-1α的影响.AHR在乳腺癌,前列腺癌,胃癌,小细胞肺癌,肝癌[42]和胶质母细胞瘤中有高表达,AHR可调节肿瘤特应性免疫力,并且还参与代谢重编程,促进了支持肿瘤进展的免疫逃逸[43].AHR参与了Treg细胞的分化,配体激活AHR的剂量和持续时间可以促进CD4 T细胞分化为Th17细胞和Treg[44].此外,AHR还促进CCR2表达,促使TAM募集以响应CCL2,并驱动CD39的表达,其通过与CD73合作产生腺苷导致CD8T细胞功能障碍[45].上述研究表明,AHR是可能治疗HCC的潜在治疗靶标,AHR拮抗剂联用化学治疗剂可能更有效的杀死癌细胞.

2.4 B7家族

2.4.1 含IgV区域的T细胞活化抑制剂:含IgV区域的T细胞活化抑制剂(V-domain Ig suppressor of T cell activation,VISTA,也称为PD-1H),与 PD-L1相似,是B7家族中的阴性检查点调节剂.负性共刺激分子VISTA作为第二信号来激活T淋巴细胞来调控免疫.VISTA在抗肿瘤免疫方面越来越受到重视,但其具体调节机制尚不明确.据报道[46],在结直肠癌患者中,VISTA与HIF-1α活性有相关性,缺氧诱导的VISTA在MDSC上的表达有助于抑制T细胞的增殖和活化,表明在肿瘤缺氧TME中,HIF-1α通过上调VISTA的表达可以帮助肿瘤细胞逃避免疫反应的伤害.在高度表达VISTA的高风险组HCC患者中,总生存率和无复发生存率显着降低[23],VISTA通过增加抑制性免疫细胞的活性来促进肿瘤细胞的免疫逃逸.在癌组织中,VISTA抑制髓样细胞中Toll样受体介导的MAPK/AP-1和IKK/NF-κB信号级联炎症反应的激活[47],而VISTA阻断剂可通过减少肿瘤TME中单核细胞衍生的抑制细胞数和肿瘤特异性Foxp3(+)CD4(+)调节性T细胞,增加活化DC细胞的数量来改变TME的免疫抑制特征[48].在HCC中,VISTA通路与PD-1/PD-L1通路共同抑制T细胞是无冗余的[49],当肿瘤免疫治疗出现抗性时,VISTA可能是其中的一个补偿性抑制因素.由于多种因素的影响,抗PD-1/PD-L1免疫疗法仅对部分癌症患者有效,VISTA作为基于抗PD-1/PD-L1的免疫疗法的耐药标记,需要针对VISTA进行靶向治疗才能在获得更好的临床效果[50],表明VISTA靶向治疗可作为有效补充性治疗.VISTA是一种新型的抑制性免疫检查点蛋白,是改善癌症免疫疗法的有希望的靶标,虽然其在人类癌症的肿瘤微环境中高度表达,但HCC患者中关于VISTA对微环境的影响及HIF-1α通过VISTA 来对免疫调控机制的相关研究相对较少.

2.4.2 PD-L1:PD-L1属于B7家族.近年来,大量研究表明,PD-1及PD-L1的单克隆抗体作为免疫疗法在癌症的治疗上是新的大突破,并已成为共识,PD-L1的过度表达成为观测癌症预后不良的重要指标.HCC癌组织中PD-L1与HIF-1α的表达呈正相关,PD-L1和HIF-1α的共表达被认为是总生存期和无复发生存期的两独立预后因素[51],这样的HCC患者预后最差,缺氧导致MDSC、TAM、DC和肿瘤细胞上PD-L1上调,而PD-L1的上调依赖于HIF-1α[52],其中的分子机制尚不清楚.有学者[53,54]认为,HIF-1α是PD-L1 mRNA和蛋白质表达的主要调节剂,PD-L1是HIF-1α的直接靶标,HIF-1α通过直接与HRE结合来调节PD-L1的表达,以增加MDSCs中细胞因子IL-6和IL-10以及TGF-β1的分泌,抑制T细胞的功能.此外,缺氧和PD -L1上调之间的事件也与ROS有关,HIF-1α和ROS的表达在缺氧条件下逐渐增加,并通过JAK/STAT3途径诱导PD -L1表达[55].我们还可以参考人参二醇通过阻断低氧诱导的HIF-1α和STAT3之间的相互作用来抑制PD-L1表达[56],以及间变性淋巴瘤激酶阳性的肺腺癌在缺氧TME中HIF-1α和STST3信号传导诱导PD-L1表达上调,来进一步强调HIF-1α和PD -L1信号之间的关系.另外,HIF-1α可通过HRE诱导IKKβ转录,并介导随后的核易位和NF-κB的活化,NF-κB通过直接与PD-L1启动子结合而激活PD-L1的表达[57].总之,HIF-1α与PD-L1变化呈正相关性.相反,在使用一氧化氮(nitric oxide,NO)信号的激动剂后,低氧细胞中HIF-1α积累和PD-L1表达降低,肿瘤细胞对CTL介导癌细胞裂解的抵抗力减弱[58].Graham等[59]认为,NO信号传导干扰HIF-1α和PD-L1积累的机制在于,NO激活cGMP信号传导,从而阻止了这种低氧反应,而Hays等[60]则认为,NO下调转录因子Yin-Yang 1的表达,是NF-κB途径被抑制的结果,在使用NO供体治疗后Yin-Yang 1被抑制,同时PD-L1的表达被下调.我们可以初步确定,在缺氧TME下,依赖HIF-1α的PD-L1可协助肿瘤细胞进行免疫逃逸.

2.5 核受体超家族 核受体超家族(nuclear receptor superfamily,NRs)是配体激活的转录因子家族,核受体与配体结合后,受体的构象变化有助于将转录共调节蛋白募集到受体特异性基因启动子复合体上,以激活或抑制转录[61].核受体不仅可与配体结合,也可通过细胞因子信号传导来调节核受体活性,其信号传导异常会导致各种恶性肿瘤和代谢紊乱疾病.近年来最受关注的核受体家族之一的视黄酸受体相关的孤儿受体(retinoic-acidreceptor-related orphan receptors,RORs),其亚家族主要包括RORα,RORβ,RORγ (RORA-C或NR1F1-3).有人认为,低氧/HIF-1α可以通过改变核受体的表达以及由核受体和免疫反应调节的分子途径来影响生物学,并在鼻息肉的发病中,证明了HIF-1α诱导的Tregs中的核受体RORγ表达可能起关键作用[62].随后陆续有学者证明了HIF-1α通过核受体表达来影响肿瘤生物学.在原发性和转移性黑色素瘤中,Brożyna等[63]证明维生素D受体、RORα、RORγ的表达与缺氧和/或HIF1-α活性有关,HIF-1α与VDR表达负相关,与RORα和RORγ表达正相关,这也影响了FoxP3的表达,最后通过调节Treg细胞的的活性来实现免疫调控.在HCC的TME中,RORγ是HCC的重要调节因子,RORγ启动子甲基化功能异常并且过表达[64],Matsui-Hasumi等[65]发现了在HCC中通过SIAH1/2-HIF-1α-Rorγt-IL-17A轴引起Th17细胞产生IL-17的新调控机制,而Rorγt (RORγ分1和2同种型,RORγ同种型2也称为RORγt)是Th17细胞中可能促进癌症进展的重要转录因子.另外,RORα与HIF-1α的相互影响可形成反馈环.虽然RORα的低氧诱导依赖于HIF-1α,但RORα又对HIF-1α的核积累和转录活性的激活起关键作用[66].这些数据表明,具有抑制Th17细胞或HIF-1α发育潜能的ROR靶向抑制剂的开发可能在癌症的治疗中具有潜在的临床意义.

2.6 自噬 自噬是细胞应对应激条件(例如缺氧、饥饿)的保守分解代谢过程,可将细胞质成分和细胞器通过自噬小体传递至溶酶体进行降解和再循环,并产生用于能量产生和生物合成的底物.在癌症中,自噬可以抑制肿瘤的发生但又支持肿瘤的发展[67].正常细胞中的自噬可维持基因组稳定性,保证蛋白质和细胞器的完整性而充当肿瘤抑制剂,自噬促癌作用则用在已建立的肿瘤的生长上.在HCC中,尤其处于晚期患者,自噬将有助于HCC细胞在各种应激条件下的存活,通过免疫逃逸促进肿瘤的发展.

缺氧TME中的HIF-1α与自噬相关[68],可引发免疫细胞的功能减弱.在黑色素瘤细胞中,缺氧诱导自噬,连接NK细胞与黑色素瘤免疫突触间隙的连接蛋白被降解,导致癌细胞对NK细胞介导的杀伤力的敏感性降低[69],同时,癌细胞可通过自噬来降低NK细胞衍生的颗粒酶B,从NK细胞介导的杀伤中逃逸[70].有研究证明,罗格列酰胺抑制自噬并恢复了非小细胞肺癌中NK细胞衍生的颗粒酶B的水平,因此增加了癌细胞对NK细胞介导杀伤的敏感性[71].对于T细胞,自噬使癌细胞逃避细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤,抑制TH9效应细胞的分化,从而限制了T细胞的抗肿瘤特性[72].作为自噬抑制剂的抗疟药羟氯喹抑制肿瘤细胞的抗免疫性成为研究热点.在难治性转移性结直肠癌患者中,羟氯喹结合组蛋白脱乙酰基酶抑制剂伏立诺他抗肿瘤治疗可抑制自噬,并显着降低了CD4+CD25+Foxp3调节性CD4和CD8 T细胞数量,从而提高了抗肿瘤免疫力[73].

此外,肿瘤细胞的自噬引起放疗、化疗抗性也引起人们的注意.射频消融的不足之处是可以通过HIF-1α/BNIP3途径增强自噬来促进体外残留的HCC癌细胞进展[74].有人证明了在缺氧条件下,HIF-1α诱导miRNA-210表达,通过下调结肠癌细胞中自噬相关分子Beclin-2的表达来增强自噬,降低放射敏感性[75].另外,HIF-1α和组蛋白去乙酰化酶可介导p53与RAS信号通路的相互作用,通过细胞凋亡和自噬调节异常,控制卵巢癌顺铂耐药[76].越来越多的证据表明自噬抑制作用可能导致癌细胞免疫力的提高,免疫治疗一方面可强力杀伤癌细胞,另一方面又诱导自噬通量增高促进肿瘤细胞的存活,这也是部分HCC患者免疫治疗产生治疗抗性的原因.靶向自噬治疗可能成为治疗HCC的新型抑制剂并且有效的提高癌症免疫疗法的疗效.

3 结论

综上所述,HCC有着极其复杂的TME,其中缺氧是重要的环境因素,HIF-1α作为细胞对低氧应激反应的主要调节因子,参与了HCC细胞的免疫逃逸,对HCC的发生发展起着不可或缺的作用.免疫疗法的出现是治疗HCC的重大突破,是晚期HCC最有希望的疗法,但目前部分HCC患者仍对免疫治疗产生耐药性,我们通过研究HIF-1α在肝癌中对免疫调控的作用机理,将靶向HIF-1α治疗作为补充性疗法并与当前的治疗方案结合使用以提高疗效,这将是一个有希望的研究领域.