应用二乙酰一肟分光光度法 准确测定牛乳中尿素的含量

庞雨樵 王域洁 张国彤 王怀斌 沈晓丽

正常牛奶中的尿素含量约200-300mg/L，近年来，一些不法商家为了提高利润空间，在牛乳中加入尿素虚高蛋白质含量，而高浓度尿素会造成泌尿系统排泄障碍，导致身体电解质失衡，对人体造成损害。因此，测定牛乳中尿素的含量十分重要。

目前，尿素含量的检测方法主要有二乙酰一肟比色法、流动注射分析仪法、电化学发光法、液相色谱法等，对牛乳中尿素的定量检测方法较少。笔者通过参考和借鉴游泳池水中尿素含量的测定及牛乳前处理的方法，对牛乳中尿素含量的测定进行了实验和探索论证，根据二乙酰一肟与尿素的反应原理，对影响尿素显色反应的实验条件做了选择研究，最后对该方法的精密性、回收率及检测限进一步验证，最终确定该方法可应用于牛乳中尿素含量的检测。

一、材料与仪器

1.实验原料。实验用乳购于超市中不同品牌的袋装奶及农贸市场销售的散装奶。

2.主要仪器。SP-756P紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），普利赛斯ES225SM-DR分析天平（瑞士普利赛斯公司）。

3.试剂。（1）尿素标准物质（99.8%）：准确称取尿素纯品标准物质100mg，溶于0.05mol/L硫酸中，轻轻振摇，使尿素完全溶解，并于100mL容量瓶中定容至刻度，使最终浓度为1000mg/L，混匀后将其转入棕色瓶中，于-4℃冰箱中保存备用。（2）尿素标准使用液：吸取10.0mL的尿素标准储备液并用纯水稀释至100mL，使其浓度为100mg/L。（3）二乙酰一肟溶液（0.5%）：称取5.0g二乙酰一肟并溶于水中，用容量瓶定容至1000mL。（4）三氯化铁-氨基硫脲-硫酸混合试剂：将200mL的浓硫酸缓缓加入800mL水中，冷却后加入0.1g三氯化铁和1.0g氨基硫脲，用纯水定容至1000mL。（5）亚铁氰化钾溶液（10.6%）：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解定容至100mL。（6）乙酸锌溶液（22.0%）：称取乙酸锌22.0g，加水溶解并加入5.0mL冰乙酸，定容至100mL。

二、实驗方法

1.实验原理。二乙酰一肟在酸性条件下水解转化为双乙酰，与尿素在强酸条件下缩合成为红色的二嗪化合物。该化合物颜色的深浅与尿素含量成正比，在波长525nm处有最大吸收峰。

2.测定方法。取混匀样品10.0mL于100mL容量瓶中，加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液各4.0mL，用纯水定容，振摇均匀。放置30min后，取10.0mL上清液，加入2.0mL二乙酰一肟溶液，再加入三氯化铁-氨基硫脲-硫酸混合试剂10.0mL，混匀。将上述各管在沸水浴中加热14min，置流动水中冷却2min，并用纯水稀释至25mL。以纯水作参比，用1cm比色皿，于525nm波长处测定吸光度值。

3.实验条件。（1）吸收波长的确定。取适量标准溶液，在480nm-560nm范围内进行全波长扫描，结果见图1。

由图1可知，吸光值在480nm-525nm范围内逐渐增加，且在525nm处达到最大，在525nm-560nm范围内又逐渐减小，由此确定最佳吸收波长为525nm。

（2）反应温度的选择。由于该反应在常温下显色反应进行得很慢，故考虑在加热的水浴中进行反应，分别将水浴锅的温度设置为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，观察其显色反应，做出反应温度与吸光度的关系图，详见图2。

由图2可以看出，样品吸光度受温度影响较大，随着温度的升高而不断增大，在温度接近100℃时，吸光度达到最高，所以选择沸水浴加热为最佳的温度条件。

（3）反应时间的选择。取8支比色管，加入标准溶液后分别置于沸水浴中，按照6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min的反应时间，考察最后吸光值的变化情况，结果见图3。

由图3可知，在6-13min，溶液的颜色较浅，显色不完全，吸光度也较小，随着水浴时间的延长，尿素显色反应吸光值呈逐渐上升趋势，增加较明显；在14-18min，溶液的吸光度比较稳定，可显色完全，吸光值基本达到最大值。为了提高效率，沸水浴时间定为14min。

（4）标准曲线的建立。取8支25mL具塞比色管，分别加入100mg/L的尿素标准使用液0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL。在上述各管中分别加入2.0mL二乙酰一肟溶液，再加入三氯化铁-氨基硫脲-硫酸混合试剂10.0mL，混匀后用纯水稀释至25mL。分别配制成0mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L、32mg/L、40mg/L的尿素标准系列，相当于每个管中相当标准物质的质量为0.00mg、0.05mg、0.10mg、0.20mg、0.40mg、0.60mg、0.80mg、1.00mg。将上述各管在沸水浴中加热14min，置流动自来水中冷却2min。以纯水作参比，用1cm比色皿，在525nm处测定各管吸光度值，以尿素含量对吸光度做回归分析。根据最佳实验条件，对尿素标准溶液进行吸光度的检测，得到不同浓度的尿素和吸光度的关系标准曲线，进而得到标准曲线的方程为：y=0.7629x+0.0331，相关系数：r=0.9992。详见表1和图4。

三、讨论

利用二乙酰一肟分光光度法来测定牛乳中尿素的含量，该方法标准曲线线性相关r=0.9992，检出限为0.020mg/L，样品测定的精密度为RSD=1.9%（n=9），低浓度和高浓度加标回收均达到97%。该方法操作简单快速，可以很好地应用于日常对牛乳中尿素含量的检测。

运用该法对超市及农贸市场销售的12种不同袋装奶及散装奶中尿素含量进行检测，结果发现，尿素含量最低的是10#样品（159mg/L），含量最高为11#样品（645mg/L），大部分测定结果在200-400mg/L左右。杜彦山、张志国等人曾测得牛奶中尿素含量为224.7mg/L，和本实验中的几个数据较为接近，但5#、9#、11#样品的尿素含量远远高于300mg/L，很有可能是掺假牛乳。

作者简介：庞雨樵（1981-），男，汉族，主管检验师，硕士，主要研究方向为食品、药品安全检验检测。

*通讯作者：沈晓丽（1983-），女，汉族，实验师，硕士，主要研究方向为食品、药品安全检验检测。