GANT61通过减缓滑膜细胞增殖抑制Balb/c小鼠关节炎发展

李向阳，秦苏萍，程万鹏，华 慧，于 倩，颜 超，郑葵阳，汤仁仙

类风湿性关节炎(rheumatioid arthritis,RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病，主要表现为滑膜炎症，滑膜细胞大量增殖，甚至出现“类肿瘤样增长”，关节肿胀，畸形，功能受损甚至丧失[1]。据报道[2]，类风湿性关节炎全世界发病率为0.5%～2%，尤其以女性居多。GANT61(Gli-ANTagonist 61)是一类人工合成的小分子化合物，它可以通过影响胶质瘤相关癌基因(glioma-associated oncogene,Gli)与DNA结合来选择性地阻断Gli介导的下游基因活化，是一种高度特异性的Hh-Gli信号通路下游阻断剂。已有研究[3-4]证实GANT61在胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤及相应细胞系的体内外实验中都具有较高的抑制细胞增殖与迁移的效应。在小鼠关节炎模型中GANT61的作用尚未见报道，该实验探讨了GANT61是否能够通过抑制滑膜细胞增殖，减轻滑膜炎症，从而改善关节功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物18只7～8周龄雌性Balb/c小鼠，由徐州医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器弗氏完全佐剂、GANT61均购自美国Sigma公司；牛Ⅱ型胶原购自美国Chondrex公司；CCK-8试剂盒、HE染色试剂盒购自上海碧云天公司；CFSE试剂、凋亡试剂盒均购自美国ebioscience公司；anti-mouse CD45 APC-cy7、anti-mouse CD11b percpcy5.5、anti-mouse Ly6G APC、CBA试剂盒购自美国BD公司。FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司；全波长酶标仪购自美国BioTek公司；细胞培养箱150i购自美国Thermo公司；正置显微镜BX51购自日本奥林巴斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1实验分组及步骤 小鼠随机分为3组：正常对照组(6只)，CIA组(6只)，GANT61组(6只)。将弗氏完全佐剂与牛Ⅱ型胶原等体积混匀后充分乳化，于CIA组及GANT61组小鼠尾根部皮内多点注射，15 d后相同剂量加强免疫一次，随后小鼠逐渐出现足爪红肿，关节畸形，活动受限等症状，具体方法参照本实验室研究方法及相关文献[5]。GANT61组于第二次免疫后第0、3、6、9、12、15、18、21天尾静脉注射GANT61，剂量为1 μmol/100 g鼠重。CIA组注射等剂量生理盐水，正常对照组注射等剂量生理盐水。

1.3.2关节评分 小鼠于第二次免疫后第7天开始，每3 d检测四肢关节及脚掌，对每一患病肢体进行评分。0分(正常)；1分(轻微关节红肿)；2分(中等程度的踝关节或腕关节红肿)；3分(严重的脚掌及指关节红肿)；4分(累积多关节的炎症肢体)

1.3.3病理学检查 于初免后第39天处死小鼠，包括正常对照组(正常小鼠，注射生理盐水)、CIA组(牛Ⅱ型胶原免疫小鼠，诱发关节炎)、GANT61组(牛Ⅱ型胶原免疫小鼠诱发关节炎后，注射药物GANT61)。将小鼠一侧患肢(后肢)浸泡于4%多聚甲醛固定5 d，剥除皮肤，12.5% EDTA脱钙液连续脱钙4周，隔天换液1次。石蜡包埋，病理切片，HE染色。另一侧患肢(后肢)，用于分离滑膜细胞。

1.3.4流式细胞术检测中性粒细胞变化 取各组小鼠外周血100 μl，经anti-mouse CD45 APC-cy7、anti-mouse CD11b percpcy5.5、anti-mouse Ly6G APC染色后，裂红，洗涤，流式细胞仪上机检测。

1.3.5流式CBA法检测细胞因子 取各组小鼠血清50 μl，运用流式CBA法检测炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、γ干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF)-α变化，运用FACP软件分析相应炎症因子含量。

1.3.6滑膜细胞分离 参照本实验室方法[5]，剪开皮肤肌肉层暴露膝关节并取出滑膜组织，无菌DMEM培养基清洗2次，剪成2～3 mm3的组织块，放于培养板中培养。中间换液1次，7 d后去除组织块，可得到原代滑膜成纤维细胞。取第3代细胞作为实验用细胞。其中GANT61组培养基中加入GANT61浓度为10 μmol/L。

1.3.7CFSE检测细胞增殖情况 各组取第3代细胞经消化后，PBS重悬，调整细胞浓度为(4～5)×106个/ml；加入终浓度为1 μmol/L的CFSE，混匀，37 ℃染色10 min后，洗涤2次，DMEM培养基重悬，将细胞悬液加入24孔板中，每孔1×105个细胞，37 ℃培养箱培养。3 d后取细胞，流式细胞仪检测细胞增殖。

1.3.8CCK-8法检测细胞增殖情况 各组取第3代细胞，DMEM培养基重悬，调整细胞浓度为1×106个/ml，将细胞悬液加入48孔板中，每孔1×105个细胞，同时加入CCK-8试剂10 μl，培养3 h后酶标仪测量450 nm吸光值。

1.3.9流式细胞术检测细胞凋亡 取各组3代细胞经消化后，PBS重悬，调整细胞浓度为3×105个/ml，经Annexin-V/7AAD染色后检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 关节肿胀程度及病理观察正常小鼠关节无肿胀，活动良好(图1A)，关节无炎症细胞浸润，无血管翳形成，关节腔正常(图1D)。CIA小鼠关节肿胀，活动受限(图1B)，关节周围大量炎症细胞浸润，血管翳形成(图1E)。GANT61组小鼠关节肿胀程度减轻(图1C)，炎症细胞减少，未见血管翳形成(图1F)。

图1 小鼠关节状态及病理学观察 HE染色×100A：正常对照组小鼠；B：CIA组小鼠；C：GANT61组小鼠；D：正常对照组小鼠踝关节病理图；E：CIA组小鼠踝关节病理图；F：GANT61组小鼠踝关节病理图

2.2 小鼠关节评分从初免后第21天，CIA小鼠关节评分逐渐增加，GANT61组关节评分低于CIA组；同时GANT61组从第24天开始关节评分呈现逐渐下降的趋势。见图2。

图2 小鼠关节临床评分与CIA组比较：##P<0.01；与正常对照组比较：**P<0.01

2.3 中性粒细胞CIA组小鼠中性粒细胞数量高于正常对照组；与CIA组相比，GANT61组中性粒细胞数量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 流式细胞术检测中性粒细胞变化A：中性粒细胞散点图；B：中性粒细胞统计图；与CIA组比较：#P<0.05

2.4 细胞因子CIA组细胞因子包括IFN-γ、IL-6、TNF-α浓度升高。GANT61组细胞因子IFN-γ、IL-6、TNF-α低于CIA组，并且以IL-6及TNF-α变化最大。见图4。

图4 CBA法检测细胞因子与CIA组比较：#P<0.05；##P<0.01

2.5 CFSE检测细胞增殖情况CIA组滑膜成纤维细胞大量增殖，其荧光强度小于GANT61组及正常对照组。GANT61组荧光强度虽然低于正常对照组，但是高于CIA组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 CFSE法检测细胞增殖A：细胞荧光强度流式图；B：各组细胞荧光强度统计图；与CIA组比较：##P<0.01

2.6 CCK-8法检测细胞增殖情况CIA组滑膜成纤维细胞大量增殖，其OD450高于GANT61组及正常对照组。GANT61组荧光强度虽然高于正常对照组，但是低于CIA组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 CCK-8检测细胞增殖与CIA组比较：#P<0.05；与正常对照组比较：*P<0.05

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡CIA组及正常对照组细胞凋亡率较低，但是GANT61组细胞凋亡率升高，高于CIA组及正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图7 流式细胞术检测细胞凋亡A：正常对照组；B：CIA组；C：GANT61组；D：细胞凋亡统计图；与CIA组比较：##P<0.01；与正常对照组比较：**P<0.01

3 讨论

RA以关节组织慢性炎症为特征，主要影响对称性手足小关节，受累关节疼痛，肿胀，功能受限；持续的关节滑膜炎症，过度增殖的滑膜细胞与小血管形成血管翳，同时大量的胶原酶及蛋白酶破坏软骨及骨组织，关节遭受破坏，功能受损，最终可造成关节畸形。

Hedgehog-Gli(Hh-Gli)通路在细胞的生长和分化过程中起着重要的作用，其信号传导途径为Hh-Ptch-Smo-Gli，其异常激活与肿瘤细胞的增殖分化、细胞凋亡、血管新生、侵袭转移等密切相关[6]；此外Hedgehog信号通路在调节骨骼的发育以及修复过程中也发挥着重要作用。Hedgehog信号通路的紊乱不但常常引起骨骼系统的疾病，同时在非骨骼系统也会有所表现[7]。GANT61是Hedgehog信号通路的抑制剂，它可以抑制Hh-Gli信号通路的转录因子Gli与DNA结合进而阻断下游基因的活化，是一种高度特异性的Hh-Gli信号通路阻断剂。前期研究[8-9]结果亦提示Hh-Gli通路参与了大鼠RA-SF的活化及增殖，GANT61可通过促进RA-SF细胞凋亡，进而抑制其增殖。

本文以CIA小鼠模型为研究对象，通过尾静脉连续多次给予GANT61，观察其对小鼠RA的影响。从初次免疫后15 d开始，每3 d给药1次，观察测量关节变化并进行评分，结果表明，GANT61可以减轻关节肿胀程度，降低关节临床评分。病理结果显示，GANT61可以减少炎症细胞浸润，抑制血管翳的形成，改善关节功能。

中性粒细胞是机体重要的免疫细胞，在血液中含量最为丰富，在机体感染、炎症状态时，可以被快速募集到炎症区域，发挥重要作用。在关节炎病人中，滑膜液中中性粒细胞的数量达到90%。此外在关节囊及血管翳中也有大量的中性粒细胞，对关节炎的发展有着重要的作用[10-11]。本实验中运用GANT61后可以降低中性粒细胞的数量，减轻滑膜炎症状态。

细胞因子在关节炎的发展中发挥着重要的作用，重要的细胞因子有TNF-α、IL-6、IFN-γ等[12]，这些细胞因子与免疫细胞T细胞、B细胞相互作用，加速了滑膜炎症及软骨和骨质的破坏。在Hedgehog-Gli信号传导途径中，给予外源性的Hh分子可以促进CD4+T细胞分泌IL-2，IFN-γ和IL-10[13]；Gli1的部分缺失可以下调IL-6、IL-8以及MCP-1的表达[14]。本实验在运用GANT61后，炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-6含量有所下降，虽然仍高于正常对照组，但是已经低于CIA模型组，小鼠炎症状态有所减轻。

进一步分析GANT61对小鼠滑膜细胞增殖和凋亡的影响；流式细胞术及CCK-8结果均表明GANT61可以抑制滑膜细胞的增殖。Hh-Gli信号通路可以调节细胞周期及细胞增殖，当SHH被活化以后，会加速G1-S期的进程，细胞增殖程度升高。当SHH被抑制以后，细胞增殖程度降低[15]。运用凋亡检测试剂盒，经流式检测，结果表明GANT61可以促进滑膜细胞的凋亡。