长链非编码RNA FAM83H-AS1对胃癌细胞周期、增殖和转移的影响及作用机制

王 涛，马牧原，叶晓锋

胃癌是全球第五大最常见的肿瘤，也是第三大最致命的肿瘤，在中国，每年报告超过40万例新病例，占全球总数的42%[1]。在过去的几十年中，尽管胃癌的诊断和治疗得到了显著改善，但患者的5年生存率仍然很低[2]，因此有必要探索胃癌新型治疗靶标的分子机制和鉴定。研究[3]报道表观遗传学在胃癌的进展中发挥重要调控作用，长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)属于表观遗传学的一种，在人类恶性肿瘤的发病机制中具有重要作用。lncRNA序列相似性家族83成员H反义RNA 1(lncRNA family with sequence similarity 83 member H antisense RNA 1, lncRNA FAM83H-AS1)是新近发现的lncRNA之一，在肝细胞肝癌、结直肠癌和卵巢癌等恶性肿瘤中高表达，发挥促癌基因作用[4-6]。Da et al[7]报道FAM83H-AS1在胃癌组织中表达上调，并与胃癌患者的淋巴结转移和预后相关。该文探讨了FAM83H-AS1在胃癌中发挥的具体作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与材料人胃癌细胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮细胞GES-1(美国ATCC细胞库)，DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基和胎牛血清(美国gibco公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，siRNA(广州锐博生物)，细胞周期检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物)，MTS试剂(美国Biovision公司)，Transwell小室(美国BD公司)；蛋白裂解液(北京索莱宝生物)，cyclinD1、CDK4、E钙黏蛋白、N钙黏蛋白和波形蛋白抗体(美国proteintech公司)。

1.2 细胞培养与转染MKN-45和SGC-7901细胞培养基为RPMI1640培养基，MGC-803和GES-1细胞培养基为DMEM-F12，胎牛血清浓度均为10 %，培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。将呈对数生长期的MKN-45细胞以1.0×105个/孔铺至6孔板中，分为对照组(si-NC)和实验组(si-FAM83H-AS1)，将NC siRNA和FAM83H-AS1 siRNA与lip2000混匀后加入各组细胞中，放至培养箱中培养。

1.3 qRT-PCR检测FAM83H-AS1的表达胰酶消化离心收集细胞，加入TRIzol试剂裂解细胞，提取细胞中总RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒将RNA反转录cDNA，并以cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒配制反应体系进行qRT-PCR，按2步反应进行，即95 ℃预变性5 s，以 95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s进行40个循环。每个反应样品设置3个复孔，获得各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，以2-ΔΔCt公式计算FAM83H-AS1相对表达量。FAM83H-AS1引物F: 5′-TAGGAAACGAGCGAGCCC-3′, R: 5′- GCTTTGGGTCTCCCCTTCTT-3′。内参GAPDH引物F:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,R: 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。

1.4MTS收集生长状态良好的MKN-45细胞以2 000个/孔铺至96孔板中，分为对照组(si-NC)和实验组(si-FAM83H-AS1)，每组设置5个复孔，按上述siRNA转染方法进行转染，分别在转染0、24、48、72 h时，每孔加入20 μl MTS试剂在培养箱中孵育2 h，全波长扫描仪检测490 nm的吸光度(optical density,OD)值。

1.5 平板克隆形成实验收集生长状态良好的MKN-45细胞以300个/孔铺至6孔板中，分为si-NC和si-FAM83H-AS1，每组设置3个复孔，按上述siRNA转染方法进行转染，细胞形成肉眼可见的细胞克隆团时终止培养，PBS洗3次，甲醇固定10 min，结晶紫染色，计数克隆团个数。

1.6 Transwell实验收集6孔板中转染48 h的各组细胞，基础培养基洗3次后细胞计数，1×105个细胞重悬于100 μl基础血清培养基中加至Transwell小室膜上，膜下加入含10%胎牛血清的500 μl培养基，每组设置3个复孔，放置细胞培养箱中培养。12 h后终止培养，将未转移的细胞洗去，甲醇固定10 min，结晶紫染色，显微镜下计数。

1.7 Western blot检测蛋白表达收集6孔板中转染48 h的各组细胞，加入蛋白裂解液，超声裂解10 min，4 ℃高速离心20 min，去除细胞碎片。检测蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸变性，进行电泳分离蛋白(80 V, 2 h)，蛋白湿转至PVDF膜上(350 mA, 2 h)，5% 脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜，室温二抗孵育2 h，ECL超敏化学发光曝光，Image J软件进行蛋白灰度值分析。

2 结果

2.1 FAM83H-AS1在胃癌细胞系中的表达水平采用qRT-PCR检测FAM83H-AS1在人胃癌细胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803和人永生化正常胃上皮细胞GES-1中的表达情况，FAM83H-AS1在胃癌细胞中的表达高于在人永生化正常胃上皮细胞GES-1中的表达，在MKN-45细胞中的表达最高(P<0.05)，见图1。

图1 qRT-PCR检测FAM83H-AS1在胃癌细胞系中的表达情况与GES-1比较：*P<0.05

2.2 FAM83H-AS1 siRNA转染效果验证FAM83H-AS1 siRNA干扰MKN-45细胞中FAM83H-AS1的表达效果。与si-NC相比，si-FAM83H-AS1组中FAM83H-AS1相对表达量降低(P<0.05)。FAM83H-AS1 siRNA可以干扰MKN-45细胞中FAM83H-AS1的表达，见图2。

图2 qRT-PCR 验证FAM83H-AS1干扰慢病毒感染效果与si-NC比较：*P<0.05

2.3 流式细胞仪检测细胞周期FAM83H-AS1 siRNA转染胃癌细胞MKN-45 48 h后，与si-NC组相比，si-FAM83H-AS1组细胞阻滞在G0/G1期(P<0.05)，见图3。

图3 MTS检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞周期的影响与si-NC比较：*P<0.05

2.4 MTS检测细胞增殖能力FAM83H-AS1 siRNA转染胃癌细胞MKN-45 48 h后，MTS实验检测结果显示与si-NC组相比，si-FAM83H-AS1组细胞增殖能力降低(P<0.05)，见图4。

图4 MTS检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞增殖的影响与si-NC比较：*P<0.05

2.5 平板克隆检测细胞克隆形成平板克隆形成实验检测显示与si-NC组比较，si-FAM83H-AS1组细胞克隆形成能力降低(P<0.05)，见图5。

图5 平板克隆实验检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞克隆形成能力的影响与si-NC比较：*P<0.05

2.6 Transwell实验检测细胞转移能力FAM83H-AS1 siRNA转染胃癌细胞MKN-45 48 h后Transwell实验检测显示与si-NC组相比，si-FAM83H-AS1组转移能力降低(P<0.05)，见图6。

图6 Transwell实验检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞转移能力的影响 ×200与si-NC比较：*P<0.05

2.7 FAM83H-AS1对细胞周期蛋白的影响收集转染48 h的各组蛋白，Western blot实验显示与si-NC组相比，si-FAM83H-AS1组细胞中cyclinD1和细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)蛋白的表达降低(P<0.05)，见图7、表1。

表1 各组细胞中细胞周期蛋白的相对表达量

图7 Western blot实验检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞中周期蛋白的影响

2.8 FAM83H-AS1对上皮间质转化过程 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响收集转染48 h的各组蛋白，Western blot实验显示与si-NC组相比，si-FAM83H-AS1组细胞中EMT标志蛋白E钙黏蛋白蛋白表达增加，N钙黏蛋白和波形蛋白蛋白表达降低(P<0.05)，见图8、表2。

图8 western blot实验检测干扰FAM83H-AS1的表达对MKN-45细胞EMT的影响

表2 各组细胞中EMT标志蛋白的相对表达量

3 讨论

个体化精准治疗-分子靶向治疗已经应用于其它晚期恶性肿瘤治疗[8]，但由于胃癌强大的异质性，胃癌的分子靶向药物目前仍处于临床研究阶段[9]，因此在分子水平探索胃癌的进展机制，有助于胃癌治疗靶点的研究。

lncRNA的发现为研究胃癌恶性表型的潜在生物学机制提供了见解，lncRNA是长度>200个核苷酸的RNA，其可通过与蛋白质、RNA和DNA或其他细胞大分子相互作用介导各种细胞生物学过程[3]。胃癌中越来越多表达失调的lncRNA逐渐被发现，其中胃癌组织中FAM83H-AS1表达增加，并且是胃癌总生存率和无进展生存期的危险因素[7]。而研究[5-6]报道FAM83H-AS1在肝细胞肝癌组织、结直肠癌组织、卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤患者不良病理参数和患者预后不良相关，并且FAM83H-AS1与这些肿瘤的恶性生物学行为密切相关。敲低FAM83H-AS1可以显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[4]。siRNA抑制细胞中FAM83H-AS1的表达后降低结直肠癌细胞的增殖、迁移并增加凋亡[5]。FAM83H-AS1是否与胃癌增殖转移有关引起了关注，本文在细胞水平检测了FAM83H-AS1在胃癌中的表达情况，结果显示FAM83H-AS1在胃癌细胞中表达上调，并选择其表达最高的MKN-45胃癌细胞系抑制FAM83H-AS1的表达，生物学功能实验显示干扰FAM83H-AS1的表达诱导胃癌细胞阻滞在G0/G1期，并抑制胃癌细胞的增殖活性和转移能力。与Shan et al[10]报道的沉默FAM83H-AS1表达可抑制膀胱癌细胞增殖和迁移，并诱导G0 / G1期细胞周期停滞的研究一致。

FAM83H-AS1在胃癌中为促癌因子，其发挥作用的具体机制仍需进一步研究。细胞周期调控失控导致肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤的重要特征，在生理状态下细胞具有严密的周期调控机制，其中细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶发挥关键作用。细胞周期蛋白CyclinD1是原癌基因，由于基因扩增、转录增强和染色体易位等导致其蛋白过度表达，过度表达的CyclinD1与CDK4结合，两者均是周期正性调控因子，促使细胞从G0/G1期进入S期，促进细胞分裂增殖[11]。本文采用Western blot实验检测表明抑制FAM83H-AS1的表达后，胃癌细胞中cyclinD1和CDK4蛋白的表达降低。表明FAM83H-AS1可能通过减少细胞周期cyclinD1和CDK4蛋白的表达抑制细胞的增殖。EMT是上皮细胞转化为具有间质表型的细胞的生物学过程，其在胚胎发育生理过程和肿瘤转移病理过程中均发挥重要作用[12]。研究[13]报道抑制肿瘤细胞的EMT，肿瘤细胞的侵袭转移能力减弱，EMT是肿瘤转移的重要机制之一，Western blot实验结果显示干扰FAM83H-AS1的表达后，胃癌细胞中上皮细胞标志分子E-cadherin蛋白表达增加，而间质细胞标志物分子N-cadherin和Vinmentin蛋白表达降低。表明FAM83H-AS1在胃癌中通过调控EMT促进细胞转移。