响应面法优化超声辅助溶剂提取香蕉5-羟色胺的工艺

童汉清，海金萍，*，李树长，张强

（1.广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东茂名525000；2.广东石油化工学院，广东茂名525000）

5-羟色胺是一种吲哚衍生物，分子式C10H12N2O，其英文名为5-hydroxytryptamine，简称5-HT，最早是从血清中发现的，又名血清素，其在大脑皮质及神经突触内水平很高，是一种抑制性神经递质[1-2]，它能调节情绪、精力，增强记忆力，产生愉悦的情绪，在缓解阿尔茨海默病症状中发挥积极作用[3-4]。最近的研究表明，5-羟色胺是肠道每个主要相关功能的重要介质，可以影响肠内炎症的发展和严重程度[5]；5-羟色胺衍生物可以调节人体免疫力，具有较强的抗氧化性和清除DPPH自由基活性以及抑制肿瘤作用[6-7]，而5-羟色胺系统功能紊乱可能是导致抑郁症的直接原因之一[8]。

5-羟色胺在自然界和哺乳动物组织中都普遍存在，研究人员发现在动物的血液和肠道组织、蝎子等昆虫的毒液、鱼的唾液腺等组织中存在5-羟色胺，沙棘、桃子、香蕉、红花籽、加纳籽、番茄、菠萝等植物中也存在有不同含量的5-羟色胺[9-14]。陈晨等[15]对核桃中5-羟色胺的提取及活性进行了研究。

香蕉为芭蕉科（Musaceae）芭蕉属植物，含有丰富的5-羟色胺，这种化学成分能给人带来欢乐、平静及瞌睡的信号，因此，香蕉又被称为“快乐食品”[16-18]，具有极高的有效成分提取及综合利用价值[19]。易晓敏等、唐雪娟等、白永亮等分别对香蕉低聚糖的提取进行了研究[20-22]，常秀莲等[23]研究了香蕉多酚的提取工艺，而关于从香蕉中提取5-羟色胺的研究尚未见报道。香蕉是茂名的特色水果之一，四季皆有种植且量很大，该文对香蕉中5-羟色胺进行提取研究，以期为香蕉的综合加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉（七成熟）：广东省茂名市茂南区河西农贸市场。

甲醇、氯化钠、无水碳酸钠、亚硫酸氢钠：天津市百世化工有限公司；柠檬酸、冰乙酸：天津市光复科技发展有限公司；无水乙醇：天津市永大化学试剂有限公司；对-二甲氨基苯甲醛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，以上试剂均为分析纯。5-羟色胺（对照品）：南京森贝伽生物科技有限公司。

超声波清洗机（XO-120D）：南京先欧仪器制造有限公司；数显恒温水浴锅（KW-1000DC）：江苏金坛市亿通电子有限公司；电动离心机（80-2型）：江苏金坛市环宇科学仪器厂；高速多功能粉碎机（LPE-800A）：欧凯莱芙（香港）有限公司；紫外分光光度计（UV-1800）：上海美谱达仪器有限公司；精密电子天平（JA1003）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香蕉预处理及5-羟色胺的提取流程

香蕉→清洗→去皮切片→0.4%硫酸氢钠、0.3%柠檬酸、0.4%氯化钠混合溶液护色→晾干→热风干燥、粉碎过筛→香蕉粉→以乙醇溶剂配合超声波辅助提取5-羟色胺→离心管离心→上清液即为5-羟色胺粗提液→转移至10 mL容量瓶以乙醇溶液定容→采用埃尔利希试剂分光光度法测定提取收率。

1.2.2 5-羟色胺标准曲线的制作

采用埃尔利希试剂分光光度法[24]。

准确称取0.005 0 g的5-羟色胺对照品，用甲醇配制成2.84 mmol/L的5-羟色胺标准溶液。分别移取0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL 5-羟色胺标准溶液于11个10 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl溶液稀释至4 mL，再各加入显色剂埃尔利希试剂5 mL，于50℃水浴显色30 min，取出冷却至室温（26℃～29℃），用0.1 mol/L HCl溶液定容。以试剂空白为对照，在500 nm～640 nm波长范围内扫描获得最大吸收波长584 nm处测定吸光度，以5-羟色胺对照品的浓度（g/L）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y=0.557 8x+0.023，R2=0.999 3。

1.2.3 5-羟色胺提取收率的测定

准确称取香蕉粉0.50g，在一定条件下提取5-羟色胺，离心所得提取上清液置于10 mL容量瓶中，用与提取所用相同体积分数的乙醇溶液定容，得5-羟色胺提取液。移取提取液1.0mL于10mL容量瓶中，加3 mL 0.1mol/L HCl、5 mL显色剂后摇匀，于50℃水浴30min，取出冷却至室温（26℃～29℃），再用0.1 mol/L HCl定容，测定吸光度，通过所建立的标准曲线的回归方程求出提取液中5-羟色胺的浓度，再由公式（1）计算出5-羟色胺的提取收率。

式中：c为方程所求样品溶液中5-羟色胺的浓度，g/L；V为样品溶液体积，mL；n为稀释倍数；m为香蕉粉样品的质量，g。

1.2.4 5-羟色胺提取工艺的单因素试验

1.2.4.1 乙醇体积分数对5-羟色胺提取收率的影响

准确称取0.50 g香蕉粉，固定超声时间30 min、超声温度40℃、料液比1∶20（g/mL），选取乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%的萃取溶剂，分别进行香蕉粉中5-羟色胺的溶剂提取试验，考察乙醇体积分数对5-羟色胺提取收率的影响。

1.2.4.2 超声时间对5-羟色胺提取收率的影响

准确称取0.50 g香蕉粉，固定超声温度40℃、乙醇体积分数70%、料液比1∶20（g/mL），选取超声时间为 20、30、40、50、60 min，分别进行香蕉粉 5-羟色胺的超声辅助溶剂提取试验，考察超声时间对5-羟色胺提取收率的影响。

1.2.4.3 超声温度对香蕉5-羟色胺提取收率的影响

准确称取0.50 g香蕉粉，固定超声时间40 min、乙醇体积分数70%、料液比1∶20（g/mL），选取超声温度为 10、20、30、40、50 ℃，分别进行香蕉粉中 5-羟色胺的超声辅助溶剂提取试验，考察超声温度对5-羟色胺提取收率的影响。

1.2.4.4 料液比对香蕉5-羟色胺提取收率的影响

准确称取0.50 g香蕉粉，固定超声时间40 min、超声温度30℃、乙醇体积分数70%，选取香蕉粉与萃取剂料液比为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），分别进行香蕉粉中5-羟色胺的超声辅助溶剂提取试验，考察料液比对香蕉5-羟色胺提取收率的影响。

1.2.5 5-羟色胺提取工艺的响应面优化设计

在单因素试验分析结果基础上，采用Box-Behnken响应面设计方法[25-27]，选择乙醇体积分数、超声时间、超声温度这3个对5-羟色胺提取收率影响较大的因素，设计三因素三水平响应面试验，以提取收率为响应值（Y）进行优化，所有试验均3次重复，因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 数据处理

响应面试验的数据，采用Design-Expert 8.06软件处理。

2 结果与分析

2.1 超声辅助溶剂提取香蕉果肉5-羟色胺的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对5-羟色胺提取收率的影响

5-羟色胺是一种带有极性基团（-NH2和-OH）的吲哚衍生物，可采用具有一定极性的乙醇溶液进行提取，乙醇溶剂浓度对5-羟色胺提取收率的影响见图1。

图1 乙醇溶剂浓度对5-羟色胺提取收率的影响Fig.1 Effect of ethanol solvent concentration on extraction yield of 5-HT

由图1可知，香蕉5-羟色胺的提取收率随提取剂乙醇体积分数的增大呈现先增后减的趋势，乙醇溶剂浓度为70%时，提取收率达到最大值。

2.1.2 超声时间对5-羟色胺提取收率的影响

超声波是一种机械波，有效频率一般在20 kHz～50 kHz。超声波辅助提取是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，从而达到加速提取细胞内容物的过程。超声时间对5-羟色胺提取收率的影响见图2。

图2 超声时间对5-羟色胺提取收率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction yield of 5-HT

图2表明，超声时间对香蕉5-羟色胺的提取收率有显著影响。超声作用40 min时，5-羟色胺的提取收率最大，超过40 min，蛋白质、多糖类成分等物质会溶出，影响5-羟色胺的提取，同时超声时间过长还会破坏5-羟色胺的结构，使提取收率下降。

2.1.3 超声温度对香蕉5-羟色胺提取收率的影响

超声温度对5-羟色胺提取收率的影响见图3。

由图3可知，升温初期，5-羟色胺的提取收率随着超声温度升高而增大，30℃时达最大值，之后开始下降。这是因为，升温初期萃取液黏度随温度升高而降低、湍动程度增大，从而增加传质系数，有利于溶质的扩散传质，因而萃取效果增强。但温度过高，5-羟色胺分子结构上的酚羟基会发生氧化，结构被破坏。

图3 超声温度对5-羟色胺提取收率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

2.1.4 料液比对香蕉5-羟色胺提取收率的影响

料液比对5-羟色胺提取收率的影响见图4。

图4 料液比对5-羟色胺提取收率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of 5-HT

图4表明，5-羟色胺的提取收率随着溶剂量的增大而增加，料液比1∶20（g/mL）时，再增加提取剂的量，5-羟色胺提取收率也增加不大。由于溶剂过多会造成资源浪费且不利于后续的浓缩，综合考虑，确定1∶20（g/mL）为最佳提取料液比。

2.2 响应面分析法优化香蕉粉5-羟色胺提取工艺

2.2.1 响应面试验设计及试验结果

Box-Behnken试验设计及试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及试验结果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

续表2 Box-Behnken试验设计及试验结果Continue table 2 Box-Behnken design and experiment results

2.2.2 数学模型的建立及显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件对表2中试验结果进行多元回归分析，得到香蕉粉5-羟色胺提取收率（Y）对乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、超声温度（C）的二元多项回归方程：Y=33.56+2.96A-0.58B+2.20C+0.81AB+1.17AC-0.71BC-5.67A2-0.38B2-7.19C2。

利用Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行方差分析如表3。

表3 回归方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

回归模型（p<0.000 1）极显著，失拟项（p=0.287 0>0.05）差异不显著；模型的相关系数R2=0.998 1，表明该模型与试验拟合良好；校正决定系数R2Adj=0.995 7，说明99.57%的响应值变化可以通过模型进行解释。所以可以使用该模型进行预测香蕉粉5-羟色胺的提取收率。回归模型中一次项A、B、C和二次项A2、C2差异极显著，只有二次项中B2差异不显著；交互项中AB、AC、BC差异均极显著，即乙醇体积分数和超声时间、乙醇体积分数和超声温度、超声时间和超声温度均存在交互作用，这表明各因素对香蕉粉5-羟色胺提取收率的影响不是简单的线性关系。

2.2.3 因素间交互作用分析

因素间交互作用的响应面图与等高线图如图5～图7所示。

图5 乙醇体积分数和超声时间的交互作用对5-羟色胺提取收率的影响Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of ethanol volume fraction and ultrasonic time on extraction yield of 5-HT

图6 乙醇体积分数和超声温度的交互作用对5-羟色胺提取收率的影响Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of ethanol volume fraction and ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

图7 超声时间和超声温度的交互作用对5-羟色胺提取收率的影响Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

乙醇体积分数、超声时间、超声温度及其交互作用对响应值的影响可以从图中直观地反映出来，等高线的形状可以反映其交互作用的大小，当等高线的形状为椭圆形时，说明其交互作用显著；当等高线的形状为圆形时，说明其交互作用不显著[28]。由图5～图7可知，在交互作用对5-羟色胺提取得率的影响中，超声时间与乙醇体积分数、超声温度与超声时间的交互作用较为显著。

2.2.4 最优工艺条件的预测及验证

通过该回归方程求得优化后的香蕉果肉5-羟色胺的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数72.30%，超声时间32.76 min、超声温度32.08℃，该条件下5-羟色胺提取收率为34.342 5 mg/g。考虑实际操作的简便性，将优化后工艺条件修正为：乙醇体积分数72%，超声时间33 min、超声温度32℃，并在此条件下进行3次验证试验。结果显示，该条件下香蕉5-羟色胺提取收率的平均值为32.986 7 mg/g，与理论预测值34.342 5 mg/g的相对误差为3.95%，小于5%，因此应用响应面分析方法优化得到的工艺参数结果可靠。

3 结论

以香蕉为试验原料，采用超声辅助乙醇溶剂提取其果肉粉中的5-羟色胺，通过单因素试验选择乙醇体积分数、超声时间和超声温度作为影响5-羟色胺提取收率最大的3个因素。考虑到因素间的交互影响，利用Box-Behnken原理设计三因素三水平优化试验，建立了香蕉粉5-羟色胺提取收率的数学模型，在料液比为1∶20（g/mL）的条件下，确定提取香蕉粉5-羟色胺最佳的工艺为：乙醇体积分数72%，超声时间33 min、超声温度32℃；在此工艺条件下，香蕉粉5-羟色胺提取收率为32.986 7 mg/g，与预测值的相对误差为3.95%，说明响应面法优化提取工艺条件真实可靠。