HPLC 法同时测定风寒感冒颗粒中7 种成分

何 艳，胡小祥，汪 毅，张 辉

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000；3.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025）

风寒感冒颗粒是由麻黄、葛根、紫苏叶、防风、桂枝、白芷、陈皮、苦杏仁、桔梗、甘草、干姜11 味药材加工而成的中药复方制剂，具有发汗解表、疏风散寒的作用，临床用于治疗风寒感冒、发热、咳嗽、头痛、恶寒、鼻塞等症［1］。方中麻黄解表发汗、宣肺平喘，桂枝解肌发表、温经散寒，两者相须为用，共为君药；葛根解肌退热，紫苏叶、防风、白芷辛温疏风、散寒止痛，为臣药；陈皮、苦杏仁、桔梗宣肺化痰止咳，干姜温肺散寒，为佐药；甘草调和药性，功兼佐使之用，诸药配伍，共奏发汗解表、化痰止咳、疏散风寒之功效。该制剂现收载于卫生部《药品标准中药成方制剂》第一册中，但其质量控制标准里仅有“性状”和“检查”项，尚无“含有量测定”项，而且现有相关文献也仅针对其中1～2 种成分进行定量分析［2-6］，不能从整体上控制其内在质量。

为了更好地提高和控制风寒感冒颗粒质量，本实验参考中药质量标志物确定原则［7］，采用HPLC法同时测定方中君药麻黄主要成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱［8］，臣药葛根主要成分葛根素［9］、防风主要成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷［10］，佐药陈皮主要成分橙皮苷［11］，使药甘草主要成分甘草酸［12］的含有量，以期为提高该制剂质量标准及临床用药稳定性提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（DAD）、自动进样器、四元泵、柱温箱（美国安捷伦公司）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国密理博公司）；XSE-205 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药物与试剂 盐酸麻黄碱（批号171241-201809，纯度100.0%）、盐酸伪麻黄碱（批号171237-201510，纯度99.8%）、葛根素（批号110752-201615，纯度95.4%）、升麻素苷（批号111522-201511，纯度94.8%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201509，纯度95.8%）、橙皮苷（批号110721-201617，纯度96.1%）、甘草酸铵（批号110731-201619，纯度93.0%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。风寒感冒颗粒（批号A20181168、A20190211，每袋装8 g，贵州百灵企业集团制药股份有限公司；批号ZAA1922、ZBA1803，每袋装8 g，云南白药集团股份有限公司；批号818136，每袋装8 g，葵花药业有限公司；批号181110，每袋装8 g，吉林长白山药业集团股份有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯（德国默克公司）；其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（含0.1%NH4Cl）（B）梯度洗脱（0～15 min，4%～7%A；15～30 min，7%～13%A；30～45 min，13%～20%A；45～60 min，20%～50%A；60～65 min，50%A；65～66 min，50%～4%A；66～70 min，4% A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；0～20 min 在210 nm 波长处检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱，20～50 min 在250 nm 波长处检测葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷，50～55 min 在284 nm 波长处检测橙皮苷，55～70 min在250 nm 波长处检测甘草酸；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品盐酸麻黄碱8.11 mg、盐酸伪麻黄碱6.50 mg、葛根素9.87 mg、升麻素苷5.94 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷5.76 mg、橙皮苷7.94 mg、甘草酸铵7.97 mg（甘草酸质量＝甘草酸铵质量/1.020 7），置于25 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，分别精密吸取2、2、8、2、2、4、4 mL，置于25 mL量瓶中，振摇，70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为25.95、20.76、120.5、18.02、17.66、48.8、46.48 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液制备 取颗粒5 袋，将内容物倒入研钵中研细，精密称取粉末1.5 g，置于锥形瓶中，精密加入50 mL 甲醇-1%HCl（7∶3），称重，超声（300 W、40 kHz）提取30 min，冷却至室温，甲醇-1% HCl 补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按颗粒处方工艺，分别制得缺麻黄、缺葛根、缺防风、缺陈皮、缺甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，0.45 μm 微孔滤膜过滤，各精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰的分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸峰面积 RSD 分别为 0.69%、0.84%、0.26%、0.47%、0.32%、0.19%、1.60%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批颗粒（批号A20190211），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、4、10、18、24、36 h 在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸峰面积RSD 分别为1.03%、1.06%、0.61%、1.73%、0.66%、0.90%、2.38%，表明溶液在36 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批颗粒（批号A20190211），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸含有量RSD 分别为1.20%、1.89%、1.23%、2.14%、1.45%、1.35%、2.23%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取同一批各成分含有量已知的颗粒（批号A20190211），研细，精密称取0.75 g 粉末，共6 份，按100%水平精密加入对照品溶液（0.183 2 mg/mL 盐酸麻黄碱1 mL、0.103 8 mg/mL盐酸伪麻黄碱1 mL、0.335 0 mg/mL葛根素5 mL、0.157 4 mg/mL 升麻素苷1 mL、0.110 4 mg/mL 5-O-基维斯阿米醇苷 1 mL、0.226 4 mg/mL橙皮苷4 mL、0.250 7 mg/mL 甘草酸2 mL），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸平均加样回收率分别为98.96%、97.81%、99.83%、97.80%、99.90%、101.06%、96.87%，RSD 分别为2.05%、2.88%、2.23%、2.17%、1.15%、1.73%、1.10%。

2.4 样品含有量测定 取6 批颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 检测波长筛选 本实验采用DAD 检测器，在紫外光区（190～400 nm）对各成分进行扫描，并采集紫外光谱图。结果，在210 nm 波长处盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱有最大吸收，在250 nm 波长处葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸有最大吸收，在284 nm 波长处橙皮苷有最大吸收，故选择三者作为检测波长。

3.2 色谱条件筛选 本实验首先考察了Agilent Eclipse Plus-C18、Thermo Hypersil Gold-C18、Waters Sunfire-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），发现Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱分离效果最好，峰型较佳。再考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1% 磷酸（含0.1% NH4Cl）流动相［8，13-14］，发现乙腈-0.1% 磷酸（含0.1%NH4Cl）梯度洗脱时盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰形最好，而且各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称性理想。最终，确定为“2.1”项下色谱条件。

3.3 提取方法筛选 本实验首先考察了回流、超声提取，发现两者提取率差异不明显，但后者更简便易行。考察了提取溶剂甲醇、70% 甲醇、1% 盐酸甲醇、甲醇-1%HCl（7∶3），发现甲醇、1% 盐酸甲醇提取时提取率较低，色谱峰拖尾较严重；70%甲醇提取时盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱提取率较低，峰形较差；甲醇-1%HCl（7∶3）提取时各成分提取率最高，并且杂质干扰少，色谱峰峰形良好。然后考察了提取时间20、30、40、50 min，发现在30 min 时各成分已基本提取完全。最终确定，最优提取方法为甲醇-1% HCl（7∶3）超声提取30 min。