生脉注射液中4 种成分测定及HPLC 特征图谱建立

梁 悦 刘 涛 李松洋 叶 萌 王 晨 吴 磊

（1.四川省中医药科学院， 四川 成都 610041； 2.成都大学， 四川 成都 610106）

生脉注射液现行标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十五册（WS3-B-2865-98-2011），但其中规定的指纹图谱方法所得色谱峰1、2、3、7、8、9、10、15、16 均未达到基线分离，尚有待进一步提升；对色谱柱要求高（亲水柱），导致在实际操作过程中增加了分析成本，不利于推广使用；仅对红参有效成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1及五味子中五味子醇甲含有量进行了测定，尚未涉及其余类型人参皂苷、木脂素及麦冬有效成分。

一测多评法是指选取1 个内标，通过建立它与其他成分的相对校正因子来测定含有量，可很好地解决中药成分分离难度大、单体不稳定、价格昂贵等问题，具有检测成本低、分析速度快等诸多优势［1-5］。目前，该方法已在中药行业中得到广泛应用［6-9］，并收录于2015 年版《中国药典》，从2010年版的1 个品种增至9 个。

特征图谱常通过HPLC、GC、LC-MS、GC-MS等手段建立，其中HPLC 特征图谱具有可操作性强、分析速度快、分辨率高、重复性好等特点，目前己成为主流分析方法［10］，既能完整表达中药整体物质信息及特征，又可对其质量进行全面评价［11-12］。但该技术也存在一些缺陷，例如它作为定性控制方法具有一定模糊性，不能对所有特征峰进行定量分析；在结果分析方面采用相似度评价模式，峰面积较大的色谱峰对其影响较明显，而较小的难以得到体现。

本实验首先建立一测多评法同时测定生脉注射液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 的含有量，并在此基础上建立HPLC 特征图谱进行质量控制［13-15］，两者联用既能全面控制该制剂质量，又能对每个共有峰进行定量分析，从而为其质量标准建立提供参考。

1 材料

Waters 2695 高效液相色谱仪［沃特世科技（上海）有限公司］；SQP 电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。人参皂苷Rg1（批号150924，纯度≥98%）、人参皂苷Rb1（批号16060402，纯度≥98%）、五味子醇甲（批号110857-200405，纯度≥98%）、麦冬皂苷C（批号180411-047，纯度≥98%）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司。生脉注射液来自4 个厂家，共17 批（编号1～17），每支10 mL。

2 方法与结果

2.1 一测多评法建立

2.1.1 色谱条件 Supersil ODS2 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长203 nm；进样量10 μL，色谱图见图1。由此可知，各成分分离度良好。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含四者1.027、1.074、0.247、1.101 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取注射液适量，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 相对校正因子测定 以人参皂苷Rb1为内标，计算其他3 种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s＝fk/fs＝（CkAs）/（CsAk），其中Ck为其他成分质量浓度，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标质量浓度，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量，依次稀释2.5、4、6.25、10、20 倍，作为线性溶液A～E，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。以S/N＝10为定量限，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 定量限分别为9.1、13.2、6.2、17.5 ng。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.1.5.2 精密度试验 取“2.1.5.1”项下线性溶液A，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 峰面积RSD 分别为0.16%、0.21%、0.10%、0.32%，表明仪器精密度良好。

2.1.5.3 重复性试验 取注射液（厂家D，批号170504）适量，按“2.1.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 峰面积RSD 分别为0.38%、0.41%、0.62%、0.65%，表明该方法重复性良好。

2.1.5.4 稳定性试验 取注射液（厂家D，批号170504）适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 峰面积RSD分别为0.16%、0.22%、0.28%、0.59%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5.5 加样回收率试验 精密量取各成分含有量已知的注射液（厂家D，批号170504）0.5 mL，共6 份，按1∶1 比例加入对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.1.5.6 耐用性试验 考察不同柱温、体积流量、色谱柱、仪器对相对校正因子的影响，结果见表5～8，可知均无明显影响（RSD＜5.0%）。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表6 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表7 不同色谱柱对相对校正因子的影响Tab.7 Effects of different columns on relative correction factors

表8 不同仪器对相对校正因子的影响Tab.8 Effects of different instruments on relative correction factors

2.1.6 色谱峰定位 以人参皂苷Rb1为内标，测定其他3 种成分在不同仪器、色谱柱下的的相对保留时间，结果见表9，可知均无明显影响（RSD＜5.0%）。

表9 各成分相对保留时间Tab.9 Relative retention time of various constituents

2.1.7 样品含有量测定 精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含有量，结果见表10，可知2 种方法所得结果无明显差异（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含有量测定结果（μg/mL）Tab.10 Results of content determination of various constituents（μg/mL）

2.2 HPLC 特征图谱建立 采用国家药典委员会相似度评价软件（2004 版）建立注射液对照特征图谱，见图3，与现行标准（WS3-B-2865-98-2011）比较，其色谱峰分离情况更理想。再对17批样品进行特征图谱采集，见图4，发现了8 个共有峰，以3 号峰（人参皂苷Rb1）为参照，测定其他共有峰的相对保留时间、相对峰面积，以两者平均值的±20%为范围，结果见表11。

图3 生脉注射液对照特征图谱Fig.3 Reference characteristic chromatogram of Shengmai Injection

3 讨论与结论

中成药成分复杂，尤其是复方制剂，其种类更为繁多，作用机制也更为复杂。药理研究表明，中成药不是某种单一成分发挥作用，而是多种成分同时作用在同一或不同靶点来发挥疗效，因此研究单一或个别几种成分难以全面准确地对其进行综合评价［16-17］，而特征图谱的引入很好地解决了这一问题。

图4 17 批样品HPLC 特征图谱Fig.4 HPLC characteristic chromatograms of seventeen batches of samples

表11 各共有峰相对保留时间、相对峰面积Tab.11 Relative retention time and relative peak areas of various common peaks

本实验中一测多评考察部分均按照王智民研究员课题组提出的“一测多评法建立的技术指南”进行［18］，并且认为在方法学考察时除了按照指南对分析方法、供试品制备方法等进行验证外，还应关注校正因子以验证其准确性。以人参皂苷Rb1为内标时，能同时测定人参皂苷Rg1、五味子醇甲、麦冬皂苷C 的含有量，从而对生脉注射液中各药材质量进行控制，并且在该色谱条件下各色谱峰分离情况良好，解决了现行标准检测分析成本高、误差大（选定的多个共有峰均未达到基线分离）的问题。另外，目前在指纹/特征图谱的定性研究中以相似度为评价指标，可控性不强，故本实验采用相对保留时间、相对峰面积对各共有峰进行控制，并规定了两者范围，能从整体上控制产品质量。

综上所述，本实验首次将一测多评法与HPLC特征图谱相结合来控制参麦注射液质量，可充分发挥两者优势，对该制剂同时进行定性、定量控制，弥补了目前指纹/特征图谱只能用于定性研究的不足。