基于TCGA数据库的肺腺癌组织中CDT1表达及相关信号通路分析

柳家翠，黄奔，许培培

1 武汉大学中南医院，武汉 430071；2 郑州大学第三附属医院

肺癌是世界上最常见肿瘤，由于该病早期症状不特异，大多数确诊时已是中晚期，伴全身多处转移，失去了最佳治疗时机[1]。研究[2]表明，肺癌患者的5年生存率只有10%～20%。近年，随着基因测序技术的发展，人们对肺癌分子发病机制的认识逐渐深入，促进了新型分子标志物的产生及靶向治疗的发展，改善了晚期或转移性疾病患者的总体生存期[3]。因此，确定与肺癌密切相关的新型分子靶点具有重大意义，能够为肺癌的分子靶向治疗提供理论及实践依据。

染色质许可和DNA复制因子1(CDT1)基因编码的蛋白质参与了DNA复制所需的复制前复合物的形成，是启动DNA复制的关键因子[4,5]。正常情况下，CDT1确保每个细胞周期只复制一次，对维持基因组的稳定性至关重要[6,7]。研究[8]表明CDT1在体内的过表达容易导致DNA复制异常，同时可激活DNA损伤检查点，在细胞系或动物体内诱发恶性转化。CDT1在乳腺癌[9]、肝癌[10]、结肠癌[11]等癌症中异常表达，并且与癌症患者的预后相关，提示CDT1可作为潜在的预后预测因子。然而，关于CDT1在肺腺癌中的表达变化及意义目前仍缺乏研究报道。本研究通过下载整理癌症基因组图谱(TCGA) 数据库中2019年11月20日之前纳入的肺腺癌表达谱数据及患者临床信息，分析CDT1在肺腺癌中的表达变化,探讨CDT1与临床病理特征及预后的相关性，并分析CDT1作用相关信号通路。

1 材料与方法

1.1 原始数据的下载及预处理 从TCGA官方网站(https://portal.gdc.cancer.gov/)检索并下载肺腺癌的表达谱数据及相应临床信息。其中，基因表达谱数据包括肺腺癌组织样本535例份，肺组织样本59例份。使用Strawberry Perl 5.30.1软件将原始基因表达谱数据整理成基因表达矩阵文件，利用R 3.6.1软件提取CDT1在肺腺癌组织样本和正常肺组织样本中的表达量数据。利用Strawberry Perl 5.30.1软件和R 3.6.1软件整理下载的肺腺癌患者临床资料，仅保留生存时间、生存状态、年龄、性别、Stage分期、T分期、N分期、M分期信息均完整的患者数据。

1.2 CDT1表达与肺腺癌患者临床病理特征及预后的相关性分析及验证 以CDT1在肺腺癌患者中表达水平的中位值(4.409)为界限，将肺腺癌患者分为CDT1高表达组和CDT1低表达组。通过χ2检验比较两组临床病理特征的差异。并根据在TCGA下载整理的肺腺癌患者的临床信息，结合CDT1表达量，利用单因素及多因素COX分析CDT1表达与肺腺癌患者临床病理特征相关性。

利用R 3.6.1软件“survival”包分析CDT1高、低表达组总体生存率(OS)的差异，并使用GEPIA在线数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)、UALCAN在线数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)及Kaplan Meier-plotter在线数据库(https://kmplot.com/analysis/)对CDT1表达及生存分析结果进行验证。具体操作方法如下：①GEPIA分析CDT1表达及预后情况设置参数：i)表达参数：Gene：“CDT1”；Dataset： “LUAD”；Matched Normal data：“Match TCGA normal and GTEx data”，其他设为数据库默认条件；ii)预后参数：Gene：“CDT1”；Methods：“overall survival”；Group Cutoff： “Median”；Dataset：“LUAD”，其他为数据库默认条件。②Kaplan Meier-plotter数据库分析CDT1表达与肺腺癌患者OS的关系详细参数如下： Gene symbol: “CDT1”; survival: “OS”; Probe set options: “only JetSet best probe set”; COX regression: “multivariate”;其他条件选择数据库默认条件。③UALCAN在线数据库分析CDT1表达与肺腺癌患者预后关系的设置条件：选择“TCGA analysis”进行分析；Enter gene symbol(s)框内填入“CDT1”；数据集选择“lung adenocarcinoma”；点击“survival”。

1.3 CDT1基因相关信号通路富集分析 使用GSEA3.0软件对CDT1进行基因富集分析。以Molecular Signature Database(MsigDB)数据库中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 数据集作为功能基因集进行富集分析。将CDT1的表达水平分为高、低表达两组。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设1 000次，其他参数设为默认值。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0软件。用Mann-WhitneyU检验分析CDT1在肺腺癌组织和肺正常组织样本中的表达差异；对CDT1表达水平与肺腺癌患者临床病理特征的相关性进行χ2检验；单因素及多因素COX比例风险回归模型用于评价CDT1与肺腺癌预后的关系；生存分析使用Kaplan-Meier法，生存曲线比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织、正常肺组织CDT1基因的表达水平比较 CDT1在肺腺癌组织表达水平(CDT1Mean=5.414)高于正常肺组织(CDT1Mean=0.734)(P<0.001)(图 1A)。在57对配对的肺腺癌组织(CDT1Mean=5.005)与癌旁正常组织(CDT1Mean=0.726)样本中，肿瘤组织CDT1表达水平较癌旁正常肺组织也显著上调(P<0.001)(图 1B)。

注：A图为TCGA-LUAD数据集中，CDT1在正常肺组织和肺腺癌组织中的表达比较；B为在TCGA-LUAD数据集中，57对配对的肺癌组织和癌旁组织中CDT1的表达比较。

2.2 肺腺癌组织CDT1基因表达与患者临床病理特征及预后的关系 肺腺癌组织中CDT1基因表达与患者临床病理特征的关系见表1。肺腺癌组织中CDT1表达量与年龄(P=0.019)、性别(P=0.049)、Stage分期(P=0.007)、M分期(P=0.042)显著相关。单因素COX分析结果显示，Stage分期、T分期、N分期和CDT1均可以作为肺腺癌潜在的预后因素(P均<0.001)；多因素COX回归分析结果提示，Stage分期(HR=1.97, 95%CI: 1.22-3.17,P=0.005)和CDT1(HR=1.43, 95%CI: 1.14～1.79,P=0.002)可以作为肺腺癌的独立预后影响因素(见表2)。

2.3 CDT1与肺腺癌预后的关系以及在线工具验证结果 CDT1高表达与肺腺癌患者不良预后有关 (P=0.029)(见图2A)。GEPIA数据库在线验证结果显示CDT1在肺腺癌组织中高表达且CDT1低表达组OS高于高表达组(P=0.001 9)(图2B)； Kaplan Meier-plotter 在线数据库分析结果表明，高表达组肺腺癌患者的OS较低(HR=2.15, 95%CI1.81～2.54,P<0.001)(图2C)；UALCAN在线数据库分析结果也显示CDT1高表达的肺腺癌患者具有较低的OS(P=0.004)(图2D)。

表1 肺腺癌组织CDT1基因表达与患者临床病理特征的关系(例)

表2 肺腺癌患者单因素和多因素COX回归分析结果

注：A为TCGA-LUAD数据集中的数据 ；B分别为GEPIA在线数据库数据；C为Kaplan Meier-plotter数据库中数据。

2.4 CDT1基因相关信号通路 CDT1基因高表达样本主要富集在细胞周期、嘌呤与嘧啶代谢、RNA降解、核苷酸切除修复以及P53信号通路中，详见表3。

表3 CDT1基因GSEA功能富集分析结果

3 讨论

DNA复制是细胞增殖的关键步骤。正常情况下，DNA复制的整个过程均受到体内分子网络的严密调控，以确保机体进行正常的细胞增殖。DNA复制错误造成的DNA损伤可导致癌转化、发育障碍和衰老[12]。DNA复制起点许可是控制细胞分裂和基因组完整性的一个进化保守步骤，该步骤主要是由微脂质体维持(MCM)解旋酶复合物的DNA装载的。CDT1蛋白是真核细胞的DNA复制起点许可过程中必不可少的组分。CDT1可与ORC和CDC6协同作用，招募并参与解旋酶MCM的核心装载[7]。因此，CDT1的任何异常都可能导致DNA复制过程出错，从而激活DNA损伤检查点诱发机体的恶性转化[13]。

Arentson等[14]在一种永生化的原始红细胞系中，通过整合逆转录病毒DNA激活了CDT1，他们发现过表达CDT1的NIH3T3细胞能够在Rag2-/-小鼠中形成肿瘤，由此鉴定CDT1是一种潜在的致癌基因。Bravou等[11]通过免疫组化检测发现，与非肿瘤性结肠上皮相比，结直肠癌灶内CDT1蛋白表达增强。另有研究者指出，在肝细胞癌中CDT1的过表达与DNA损伤反应有关，而且CDT1的过表达与肿瘤分级以及TNM分期显著相关，是肝细胞癌的重要预后生物标志物[10]。这些研究均表明了CDT1在多种肿瘤的发生发展过程中扮演了重要角色。Karakaidos等[15]报道了在非小细胞肺癌的一个亚群中，CDT1显著过表达，且与CDC6水平呈正相关，并且CDT1及CDC6的过表达与p53的突变一致，说明CDT1过表达可导致细胞过度复制，同时可影响染色体的稳定性，然而该研究并未具体分析CDT1在肺腺癌患者中的表达与临床预后的关系。

正常情况下，CDT1受到多种机制的负性调控，一旦解除对CDT1的调控可导致染色体损伤，从而导致染色体的不稳定性，进一步诱发正常细胞突变成肿瘤[16]。本研究利用生信挖掘的方法，通过下载并分析TCGA-LUAD数据集基因表达谱数据发现，与正常肺组织相比，CDT1在肺腺癌组织中的表达水平显著上调。同时有研究[17]显示，CDT1是肿瘤发展与发生浸润转移的重要因素。本研究通过χ2检验分析验证了CDT1表达水平与患者的Stage分期及远处转移具有显著相关性，多因素COX回归分析提示CDT1可作为肺腺癌的独立预后因子。 另有研究[18]发现，转基因过表达CDT1的模型小鼠生存期不超过两周，显著低于正常小鼠。本研究的生存分析以及在线工具验证结果也表明CDT1高表达的肺腺癌患者总体生存率较差。GSEA功能富集分析预测结果显示，CDT1可能参与调节细胞周期和与致癌信号相关的通路，但其参与调节的具体生物学信号通路仍有待实验验证。由此可见，CDT1基因表达水平的变化对肺腺癌发生发展具有显著影响。

综上所述， CDT1在肺腺癌患者中高表达，与肺腺癌患者的Stage分期及远处转移等相关，可作为导致肺腺癌不良预后的独立危险因子，并通过参与多种信号通路促进肺腺癌的发生发展。本研究的局限性在于仅从生物信息学角度对CDT1在肺腺癌组织中的表达变化及与患者临床病理特征、预后相关性和信号通路等进行分析，而缺乏CDT1参与肺腺癌发生发展的体内外生物学实验研究证据。因此，接下来应通过具体相关实验验证本研究中的生信分析研究结果，从而为将来CDT1作为肺腺癌治疗的分子靶点提供更多临床线索及证据。