牙髓干细胞与血管周细胞性能比较研究

2020-10-13吴文婧丁如愿张红艳胡露露

安徽医科大学学报 2020年10期

吴文婧，丁如愿，张菁，张红艳，胡露露，李颂

血管新生是组织修复的基础，血管新生异常常常影响机体损伤的正常愈合。血管由内衬血管壁的内皮细胞层和血管周细胞组成。研究[1]表明，在血管形成过程中，首先由增殖的血管内皮细胞形成管腔样结构，然后血管周细胞迁移聚集，2 种细胞共同调节血管的稳定性。周细胞在全身毛细血管和微血管周围广泛分布，能够稳定血管结构，对血管的发育以及重塑具有重要作用。然而，现阶段分离血管周细胞还有一定的困难，这限制了其在体外血管重建中的运用。有研究[2-4]报道，来源于脑组织、脐带、脂肪等的间充质干细胞和血管周细胞有许多相似之处，这些间充质干细胞在细胞表型、基因表达和分化能力等方面与血管周细胞有着高度的相似性。但是，这些组织来源的间充质干细胞获取困难，相对来说，来源于牙髓的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有无创伤、易于分离、增殖率高等优势，可以从第三恒磨牙、正畸牙或其他原因拔除的健康牙的牙髓组织中分离培养获得，而不受伦理问题的影响。在该研究中，选择血管稳定能力、迁移功能和干性分化潜能作为评价标准，比较DPSCs和血管周细胞之间的相似性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器原代血管周细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)(美国Sciencell公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；周细胞培养基(美国Sciencell公司)和ECM培养基(Lonza公司)；Transwell 细胞小室(美国BD公司)；DMEM 培养基(美国HyClone公司)；Dispase 酶和Ⅰ型胶原酶( 美国Sigma 公司)；CO2恒温孵箱(英国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1DPSCs的分离培养与鉴定取临床小于25岁健康患者因正畸或阻生拔除健康无龋的牙齿，拔出后立即放入含5%双抗PBS中，摇晃冲掉牙根表面血迹，立即冰盒保存，送至实验室。4 h内将牙齿放入超净工作台，用无菌纱布包裹牙齿，锤子砸开牙齿，超净工作台内分开牙齿，镊子取出牙髓，去掉根尖1/3根髓，将牙髓移入无菌培养皿中，用2%双抗PBS反复冲洗干净。将牙髓组织剪碎后移入15 ml离心管中，加入1 ml 浓度为3 mg/ml胶原酶和1 ml浓度为4 mg/ml Dispase酶，混匀后37 ℃震荡消化40～60 min，加入培养基终止消化，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，细胞重悬于20% 胎牛血清的α-MEM 培养液中，吹打混匀后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。3～5 d后观察细胞生长情况，以后3 d换液，培养10～12 d，当细胞长至约90%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。取P3代DPSCs，PBS 洗涤2次，用胰酶消化收集，以1×106/ml分装至1.5 ml EP管，分别加入CD105、CD29、CD90、CD73、CD45、CD44、CD34 抗体，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤后重悬，流式细胞仪检测。

1.2.2多向诱导分化成骨分化：以4×103/cm2接种于12孔板上，培养至70%融合度时，更换成骨诱导培养基(含α-MEM，10% FBS, 1%双抗, 50 μg/ml 磷酸抗坏血酸, 10 mmol/L β-磷酸甘油, 10 nmol/L地塞米松, 10 nmol/L 1,25二羟基维生素D3)培养4周，每3 d换液1次。诱导4周后，用10%中性缓冲福尔马林固定1 h，弃去固定液，用双蒸水冲洗3次，加入茜素红染色。

成神经分化：以4×103/cm2接种于12孔板上，培养至70%融合度时，更换成神经诱导培养基(含神经诱导培养基，40 ng/ml 成纤维细胞生长因子, 20 ng/ml 表皮生长因子)培养4周，每3 d换液1次。诱导4周后，检测成神经分化。

1.2.3体外成血管实验预先对48孔板进行基质胶涂层，按照DPSC+HUVEC(1 ∶4)、血管周细胞+HUVEC(1 ∶4)接种在孔板上，37 ℃与5% CO2条件下孵育。于3、7、11、14、18、24、30、36、42 h在倒置显微镜下观察小管形成情况并采集图像。

1.2.4细胞趋化实验 DPSC和HUVEC在血清饥饿24 h后，消化重悬细胞，调整细胞悬液密度为1×106/ml，上室每孔加0.1 ml HUVEC悬液，下室分别加入0.6 ml的DPSCs或血管周细胞悬液，所有样本均设有复孔，37 ℃与5% CO2条件下培养12 h。固定染色镜检，计算下表面迁移细胞数，评价DPSCs和血管周细胞对HUVEC迁移行为的影响。

1.3 统计学处理每次实验独立重复≥3次，采用GraphPad Prism 5软件对数据进行分析。数据以均数±标准差表示。两组间比较采取独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPSCs的流式鉴定流式细胞仪对DPSCs进行表面抗原的检测，结果显示细胞纯度较高，均阳性表达CD105、CD73、CD90、CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45，符合间充质来源的干细胞特征，为间充质来源(图1)。

2.2 DPSCs与血管周细胞的多向分化潜能在倒置显微镜下，DPSCs和血管周细胞均呈梭形，贴壁生长，两者表现出类似的形态学特征(图2)。

图1 流式细胞术检测DPSCs表面标志物

图2 细胞体外培养的形态学观察 ×40

DPSCs和血管周细胞经成骨诱导液诱导4周后，茜素红染色显示红色的矿化结节。经成神经诱导液诱导4周后，观察到两组细胞均缩小变窄并向两侧伸长，呈长轴突样，类似神经元样细胞的形态。发现两组细胞均能向成骨细胞和神经细胞分化，可见DPSCs和血管周细胞均具有相似的多向分化能力(图3)。

2.3 DPSCs/血管周细胞与HUVEC共培养形成稳定的管状结构本研究进行了Matrigel成血管实验，以HUVEC、DPSCs+HUVEC和血管周细胞+HUVEC在Matrigel上共培养，比较各组的成血管能力。结果显示，两组细胞均可加强由HUVEC形成的网状结构，网状结构相互连接，形成管腔样结构，并维持到42 h。可见DPSCs和血管周细胞均能增强HUVEC产生的管状结构的稳定性(图4)。

图4 体外Matrigel成血管实验结果 ×10

2.4 迁移功能DPSCs和血管周细胞与HUVEC在Transwell孵育12 h后，上室中各实验组均有一定数量的HUVEC进入下室，表明DPSCs和血管周细胞对HUVEC均有较强的趋化作用，两者间差异无统计学意义(P>0.05)(图5)。

3 讨论

血管周细胞是血管结构的重要组成部分，也称为壁细胞，嵌入在小血管、毛细血管和微血管的基底膜中[5]，在促进血管新生方面起着重要的作用，如稳定血管结构和刺激血管生成[6]。并且血管周细胞已被证明可分化为各种谱系，如肌纤维、成牙骨质细胞样细胞、脂肪细胞和软骨细胞等[7-9]。血管周细胞的多能分化能力和血管生成潜能使其成为细胞治疗的潜在候选细胞，但目前血管周细胞的分离仍然具有挑战性。2000年，Gronthos et al[10]首次从牙髓组织中成功分离出DPSCs，并进一步证明了DPSCs具有自我更新和多向分化的潜能，可以被诱导分化为骨、软骨、肌肉、血管内皮等多种细胞类型。研究发现DPSCs能分泌多种成血管因子，用DPSCs培养液培养内皮细胞可促进内皮细胞的迁移能力以及成血管能力[11-12]。有学者对DPSCs进行成血管诱导，发现DPSCs可分化为内皮样细胞，在体外可形成血管样结构[13-14]。另外，颅面血管周细胞和DPSCs均起源于颅神经嵴，DPSC的解剖位置和发育起源与周细胞相似。Shi et al[15]研究表明，大部分DPSCs表达血管周细胞标志物3G5，也证实了它们与血管周细胞的相似性。所有这些证据提示是不是可以用来源充足、获取容易的DPSCs作为血管周细胞的替代物。本研究从临床上获得牙髓组织，体外分离培养得到DPSCs，并对细胞进行验证，流式细胞仪检测显示CD105+、CD73+、CD90+、CD29+、CD44+及CD34-、CD45-，与间充质干细胞的表达一致。在细胞形态学方面，比较了DPSCs和血管周细胞后发现两种细胞均呈梭形，贴壁生长，形态无明显差异。本课题组还研究了两种细胞的分化能力，发现DPSCs和血管周细胞均能向成骨细胞和神经细胞分化。Matrigel胶成血管实验是一种常应用于血管内皮细胞功能的成血管研究的体外模型。本研究在 Matrigel上将血管周细胞或DPSCs与HUVEC共培养，两组共培养均观察到有明显的血管形成，且维持较长时间，验证了DPSCs同样也具有显著的促成血管能力。在此基础上，通过Transwell实验进一步研究DPSCs对血管内皮细胞的趋化作用。Transwell趋化实验是将被趋化细胞接种在上室内，通过小室底部的通透性膜，下层培养液中的成分可以作用到上室内的细胞，以此研究下层物质对细胞迁移的作用。将HUVEC分别和血管周细胞、DPSCs两种细胞同时培养于 Transwell的上下室，培养12 h后，可以清楚观察到两组HUVEC的迁移。初步证明了DPSCs对HUVEC也有显著的趋化作用。而血管内皮细胞的迁移对于新生血管形成是至关重要的。