类风湿关节炎患者血浆外泌体miR-16-5p和miR-223-3p的表达及临床意义

桑成晨,钱 龙

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎症性和系统性自身免疫疾病，临床主要表现为关节疼痛、肿胀、畸形，严重时可导致残疾，同时它可以累及肺、心脏和眼睛等关节外器官，并且与心血管疾病、感染、淋巴瘤和预期寿命降低的风险增加有关。RA的确切病因尚不清楚，许多研究提示环境和遗传因素综合作用参与其发病，目前认为炎症的小分子介质(如花生四烯酸代谢产物)、自身抗体、细胞因子、生长因子、趋化因子、黏附分子、表观遗传学、异常信号转导和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)均与RA的发病机制有关。表观遗传学与RA的研究进展表明微小RNA(microRNA，miRNA)与RA发病机制之间有紧密关系，近年来有学者研究证实外泌体可通过传递miRNAs参与RA发病机制[1]。该研究通过检测miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血浆外泌体中的表达水平进一步探讨外泌体miRNAs和RA之间的确切联系。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集安徽医科大学第二附属医院风湿免疫科2017年10月～2019年10月的RA住院患者56例，按照患者基于C反应蛋白(C reaction protein，CRP)水平计算的28个关节疾病活动性评分(disease activity score 28-CRP，DAS28-CRP)来区分RA活动度，其中病情活动组(DAS28-CRP≥3.2)和稳定组(DAS28-CRP<2.6)各28例。同时收集24例健康体检者作为对照组。本研究获得研究对象知情同意及安徽医科大学第二附属医院医院伦理委员会批准。

1.2 纳入、排除标准所有病例组患者诊断均符合美国风湿病学会1987年RA分类诊断标准，对照组为同期健康体检者，研究对象均为无血缘关系汉族人，各组年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)。选取的研究对象均排除感染、代谢、肿瘤和其他自身免疫性疾病。

1.3 一般资料记录所有患者以下临床资料：姓名、年龄、性别、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)滴度、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，Anti-CCP)滴度、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、CRP、关节压痛数(tender joint count,TJC)、关节肿胀数(swollen joint count,SJC)、关节超声、关节平片等，并计算RA患者DAS28评分。

1.4 实验流程采集RA患者与正常人晨血标本10 ml，离心取上层血浆后，按照试剂盒说明书使用Qiagen公司的外泌体提取试剂盒(exoEasy Maxi kit)提取外泌体。以miR-451a作为内对照，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术(RT-qPCR)对外泌体中miR-16-5p和 miR-223-3p进行定量检测，使用2-△△CT计算其相对表达水平。

2 结果

2.1 一般资料统计分析在RA组及健康对照组，RA病情活动组及稳定组中，性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 RA组与健康对照组的一般资料比较

表2 RA病情活动组与稳定组的一般资料比较

2.2 RA组和健康对照组血浆外泌体中miR-16-5p的表达RA组及健康对照组血浆外泌体中均检测到miR-16-5p，其在RA组[1.852 (1.084，2.532)]中的表达高于健康对照组[0.995 (0.572，1.798)]，差异有统计学意义(Z=-2.310，P=0.021)(图1)。

图1 miR-16-5p在RA组和健康对照组血浆外泌体中的表达

2.3 RA病情活动组和稳定组血浆外泌体中miR-16-5p的表达血浆外泌体miR-16-5p在RA活动组[1.427(0.950,2.314)]中的表达水平与RA稳定组[1.970(1.248,2.857)]相当，差异无统计学意义(Z=-1.573，P=0.116)(图2)。

2.4 RA组和健康对照组血浆外泌体中miR-223-3p的表达RA组与健康对照组外泌体中均检测到miR-223-3p，RA组[106.611(46.813，223.841)]血浆外泌体miR-223-3p的表达水平高于健康对照组[47.586 (8.115，101.347)]，差异有统计学意义(Z=-2.845，P=0.004)(图3)。

图2 miR-16-5p在RA病情活动组和稳定组血浆外泌体中的表达

图3 miR-223-3p在RA组和健康对照组血浆外泌体中的表达

2.5 RA病情活动组和稳定组血浆外泌体中miR-223-3p的表达血浆外泌体miR-223-3p在RA活动组[199.615(104.944，305.090)]中的相对表达水平比RA稳定组[53.993(21.524，107.707)]升高,差异有统计学意义(Z=-4.097，P=0.000)(图4)。

图4 miR-223-3p在RA病情活动组和稳定组血浆外泌体中的表达

2.6 血浆外泌体miR-16-5p、miR-223-3p相对表达水平与临床相关指标的相关性相关性结果分析显示，RA患者血浆外泌体miR-16-5p与RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等临床指标均无相关性(P>0.05)；miR-223-3p相对表达水平与患者RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均无相关性，但与TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR评分呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 RA患者血浆外泌体miRNAs相对表达和临床指标的相关性分析

3 讨论

RA病程中关节的破坏给患者、社会均造成了沉重负担，明确RA的发病机制、寻找其早期诊断的生物标志物及开发理想的RA治疗药物是迫切的医学需求。外泌体是一种由多种细胞分泌可进入细胞外环境的异质性囊泡，其内包含脂质、蛋白质、多种核酸等物质，Takamura et al[2]鉴定了RA成纤维样滑膜细胞系(即MH7A)的外泌体RNA，发现miR-155和miR-146a在源自MH7A的外泌体中表达，并且在TNF-α刺激后的外泌体中的表达是升高的，提示外泌体可能通过传递miRNAs参与RA发病机制。miRNAs作为进化高度保守的一类小分子RNA参与免疫系统的发育和免疫功能的调节，研究显示miR-16[3-4]、miR-223[5-6]在 RA患者的血清、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、关节滑液、滑膜组织等标本中均异常表达，因miRNAs与外泌体结合后不受内源性核糖核酸酶活性的影响而稳定存在[7]，表明外泌体miRNAs有成为新的疾病生物标志物的潜能。故本研究通过检测miR-16-5p和miR-223-3p在血浆外泌体中的表达水平，并进行临床相关性分析，进一步探讨外泌体miRNAs在RA发病及疾病进展中的意义。

miR-16被位于人类3号和13号染色体上的两个基因编码，Jing et al[8]通过分析从人细胞中分离的miR-16的序列发现miR-16包含可以与TNF-α mRNA中的ARE基因配对的UAAAUAUU序列，破坏miR-16前体pre-miR16-1后可显著降低HeLa细胞中miR-16的水平，并延长了TNF-a mRNA的半衰期，从而推测其参与ARE介导的TNF-α mRNA降解过程，而TNF-α在RA的发病机制中起重要作用，这似乎说明miR-16可能参与RA的发生。Wu et al[9]的研究进一步发现RA患者PBMC中的Th17和Treg细胞中miR-16的表达与转录因子RORγt和FoxP3的表达密切相关，说明miR-16可能通过影响RORγt和FoxP3的表达而参与RA患者的Th17/Treg失衡。随后孙寅 等[4]发现miR-16在RA患者血浆、PBMC和关节滑液中的表达水平均高于健康对照组，其表达水平由低到高分别为PBMC、关节滑液和血浆，且RA患者血浆miR-16的表达与DAS28呈负相关，PBMC中miR-16的表达与DAS28评分、ESR及CRP呈正相关。而Murata et al[10]研究结果显示滑液中miR-16的浓度与RA临床指标MMP-3、CRP、ESR、DAS28、SJC、TJC均无相关性。本研究检测了RA患者和健康对照组的血浆外泌体miR-16-5p的相对表达量，发现其在RA患者中的表达高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示其可能参与RA发病。但外泌体miR-16-5p在RA病情活动组及稳定组中的表达差异无统计学意义(P>0.05),且其表达水平与RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等临床指标均无相关性(P>0.05)，结合既往研究中miR-16在RA患者血浆、关节滑液和PBMC中的表达水平存在明显差异，考虑miR-16在不同标本中的来源不同，并可能存在不同的miRNA表达谱，需要加大样本量进行更深入的研究明确外泌体miR-16参与RA发病的作用机制。

miR-223位于人类X染色体q12上，Fulci et al[6]首次表征了RA患者外周T淋巴细胞的miRNA表达谱，与正常人相比，RA患者CD4+原始T淋巴细胞中miR-223的表达显著升高，而正常人的原始CD4 T细胞用T细胞抗原受体刺激后也未检测到miR-223的表达，说明RA患者中miR-223的过表达与RA发病相关。Sugatani et al[11]的研究显示miR-223通过转录因子PU.1/miR-223/核因子1A(nuclear factor1-A，NFI-A)/巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)反馈通路调控破骨细胞的生成。在这个反馈环中，M-CSFR可以上调PU.1水平刺激miR-223的表达，过表达的miR-223下调NFI-A水平促进破骨细胞的生成，同时NFI-A表达水平的降低使M-CSFR的表达水平升高，而M-CSFR对破骨细胞的分化和功能至关重要。随后Li et al[5]在RA患者关节滑膜和CIA小鼠模型中的实验进一步证实了Sugatani et al[11]的结论，提示miR-223可能成为RA的潜在治疗靶点。近期孙广 等[12]研究了RA患者血清外泌体miR-223的表达水平，发现RA患者血清外泌体miR-223的相对表达量显著高于健康对照组，且其表达量与RA患者DAS28评分、血清Anti-CCP滴度、RF滴度 、CRP及ESR水平正相关。在本研究中，相对于健康对照组，RA患者血浆外泌体miR-223-3p的表达增高(P<0.05)，这与孙广 等[12]的研究结果一致，同时本研究发现外泌体miR-223-3p在RA活动组的表达水平高于RA稳定组(P<0.05)，进一步说明外泌体miR-223-3p可能参与RA疾病的发展。相关性分析结果显示RA患者血浆外泌体miR-223-3p相对表达水平与RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均无相关性(P>0.05)，这个结果与孙广 等[12]的研究结果存在不同，考虑可能有以下原因：① 目前的大量研究在RF滴度、Anti-CCP滴度 、ESR及CRP水平与RA疾病活动度是否相关的问题上存在分歧，这可能与不同实验方法测定出的指标值存在差异以及活动期RA患者的炎症指标与滑膜炎严重程度并不一致[13]有关；② 来自于同一发夹结构pre-miRNA的相反两臂命名时后缀加“-3p”(表示从3′ 端的臂加工而来)或“-5p”(表示从5′ 端的臂加工而来)，如miR-223-3p 和miR-223-5p，它们在不同组织的表达量不同，本研究选取表达量较高且特异性较高的miR-223-3p进行研究，而孙广 等[12]的研究中并未提及测定的miR-223序列；③ 本研究中选择的内参与相对表达量计算方法与孙广 等[12]的不同，这可能导致了不同的结果。同时本研究中RA患者血浆外泌体miR-223-3p相对表达水平与TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR均呈正相关(P<0.05)，这说明外泌体miR-223-3p不仅参与RA的发病，还可能用来评估RA患者的疾病活动情况，但其可否成为RA的潜在治疗靶点还需要更多的实验证实。

本研究通过检测miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血浆外泌体中的表达，发现其有可能成为RA筛查、诊断、评估病情的生物标志物。考虑到目前各种研究中定量方法、不同患者的疾病活动和药物治疗情况以及样本类型(全血、分离细胞亚群、滑膜组织、滑液等) 的不一致性，应当注意这些研究结果间的偏差，这可能会推迟miRNAs作为RA疾病生物标志物的应用。