宫颈癌ING4基因启动子区甲基化状态及其临床意义

陈 艳，牛三强，胡卫平，钱莉莉

宫颈癌(cervical cancer，CC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年估计有50万例新病例，其中有30万人死亡[1]。近年来，相关报道表明， CC的发病正在向年轻化方向发展。CC与高危HPV感染有关。研究[2-3]表明，单一的高危HPV感染不足以引起CC，遗传因素和免疫因素在CC的发展中也起着重要作用。在过去的几十年中，对癌症表观遗传修饰，特别是DNA甲基化及其对肿瘤致癌作用的研究一直在不断增加[4]；然而，表观遗传因素对CC的影响仍然未知，DNA甲基化经常发生在多种癌症中，例如结肠癌、乳腺癌和CC[5-7]。尽管认为生长抑制因子4 (growth inhibitory factor 4，ING4)启动子区的CpG岛甲基化是ING4产生的负转录调节因子，但尚未在CC中研究此类事件。因此，该研究的目的是评估CC组织中ING4启动子区甲基化情况与CC发生的临床意义，并为研究CC的发生和发展提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集安徽省立医院2018年1月～2019年10月确诊的80例CC患者组织标本(CC组)，并以同期在该院治疗的子宫良性病变行子宫全切患者的50例标本作为对照组。以上患者均无术前治疗及放化疗。所有患者均经病理证实。标本收集后保存在-80 ℃直至分析使用。所有患者在收集样品前均已获得知情同意。该协议由中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)伦理委员会批准。根据WHO标准对肿瘤的组织学类型和等级进行分类。根据国际妇产科联合会(FIGO)标准确定每种癌症的分期。

1.2 方法

1.2.1组织DNA提取和亚硫酸氢盐处理 按照组织DNA 提取试剂盒步骤获取组织标本中DNA，并用分光光度仪测定核酸浓度，通过亚硫酸氢盐处理，DNA的未甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持未修饰。使用亚硫酸氢盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)对提取的基因组DNA进行修饰。修饰的DNA保存在-80 ℃存储以备后用。

1.2.2甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP) MSP是使用甲基化或未甲基化DNA的特异性引物对经过亚硫酸氢盐处理DNA进行PCR扩增，从而得到DNA是否甲基化的信息。通过MSP方法分析所有样品。同时使用UCSC网站获取ING4基因上游启动子序列约1 000 bp，Methprimer进行MSP引物的设计见图1，引物序列、退火温度和预期的产物大小见表1。聚合酶链反应(PCR)在总体积为20 μl，模板2 μl(200 ng)，10× PCR buffer 2 μl，Mg2+1.6 μl，dNTP mix 0.4 μl，DMSO 0.4 μl，MSP上下游引物(10 pmol/μl,2 μl),HS-Taq酶0.2 μl，灭菌双蒸水11.4 μl。PCR条件为95 ℃预变性5 min，开始循环，95 ℃变性20 s，使用各引物退火温度退火20 s，72 ℃延伸20 s，循环40次，最后72 ℃延伸5 min。反应在PCR仪(G-Storm GSI PCR扩增仪)中进行。使用经过SssI甲基化酶(北京NEB公司)处理后的人外周血DNA作为甲基化阳性DNA对照，该酶甲基化了DNA中CpG二核苷酸的每个胞嘧啶。每个试验都包括水空白。PCR产物在溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上可视化。仅将未甲基化引物的阳性扩增解释为未甲基化。将甲基化引物或甲基化和未甲基化引物的正扩增视为甲基化。

1.2.3RNA提取和实时定量逆转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR) 根据制造商的说明使用TRIzol(上海玉博生物科技有限公司)提取总RNA。 使用GoScriptTM逆转录系统试剂盒(北京Promega生物技术有限公司)从5 μg总RNA中制备cDNA。使用PCR试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)从5 μg cDNA中扩增ING4基因。 循环条件为在94 ℃下预变性3 min，然后进行45轮循环(94 ℃下变性30 s，在57 ℃下进行20 s退火，并在72 ℃下延伸30 s)最后的延伸步骤在72 ℃下进行10 min，并将产品存储在4 ℃下。ING4引物序列为5′-CACAAGTCCTG AGTATGGGAT-3′(正向)和5′-AGGGATGTGGAAGA AACTGT-3′(反向)，预期大小为295 bp。 GAPDH引物序列为5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG-3′(正向)和5′-CTGTTGTCGGAGTTCTAGTAG-3′(反向)，预期大小为385 bp。使用2-ΔΔCt方法计算相对基因表达，并用内源性GAPDH标准化表达数据。所有实时PCR重复3次。

表1 ING4基因MSP引物序列

2 结果

2.1 CC组和对照组临床病理特征80例CC患者和50例对照组的临床病理特征见表2。根据现有的留存病理报告，CC组与对照组在年龄、初潮年龄、绝经状态、妊娠次数、分娩次数、癌症家族史等方面差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 ING4的异常启动子甲基化ING4基因的MSP反应的代表性谱带见图2。在CC组中，ING4启动子甲基化率为82.5%(66/80)，在对照组中12.0%(6/50)，CC组中ING4基因启动子的甲基化率高于对照组(P<0.001)。

2.3 CC组和对照组患者组织标本中ING4基因表达qRT-PCR检测结果显示，CC组中ING4 mRNA表达(0.41±0.07)低于对照组中 ING4 mRNA表达(0.87±0.16)(t=22.53，P<0.01)。此外，ING4启动子区甲基化的CC患者组织中ING4 mRNA水平平(0.37±0.06,n=66)低于ING4启动子区未甲基化CC患者组织中的ING4 mRNA水平(0.46±0.11,n=14)，差异有统计学意义(t=4.318，P<0.01)。

图1 ING4基因的MSP引物设计示意图

表2 CC组和对照组的部分临床特征

图2 ING4基因启动子区部分MSP结果

2.4 ING4高甲基化与CC临床病理特征的关系根据甲基化状态，对CC组织中ING4启动子区域进行多变量分析，结果见表3。ING4启动子区的甲基化与以下临床病理特征之间差异无统计学意义：包括年龄、淋巴结转移、淋巴管侵犯、切缘侵犯、FIGO分期、组织学分型、肿瘤大小和HPV感染(P>0.05)。

3 讨论

CC是全球女性中第三大最常被诊断的癌症，也是第四大导致癌症死亡的主要原因，并且目前仍然是主要的公共卫生问题[8]。CC的发展是一个多基因、多步骤的癌变过程，涉及复杂的遗传和表观遗传机制。DNA甲基化是表观遗传修饰的一种常见形式，而通过其启动子(尤其是CpG岛)的超甲基化而沉默，与多种肿瘤的发生有关[5,9]。 Paz et al[9]报道在所分析的70个肿瘤细胞系中，至少每个都存在一个高甲基化基因。 此外，研究表明肿瘤中的癌症干细胞基因由于甲基化而被下调，例如在膀胱癌[10]、大肠癌[5]和CC[11]。 因此，基因甲基化状态的改变是参与致癌的关键因素之一。

表3 ING4甲基化状态与CC中临床病理特征的关系[n(%)]

基因表达的表观遗传修饰是环境暴露可能影响疾病的新机制，通过修饰调节基因转录的启动子区域表达。最近，有关表观遗传调控机制在CC研究重要性的证据不断涌现。DNA甲基化模式的改变，尤其是基因启动子区域的改变，可能对基因表达产生深远的影响。DNA甲基化的特征是在胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤(CpG)岛内的胞嘧啶中添加了甲基。未甲基化的CpG岛与转录活性区有关，而甲基化的DNA募集甲基结合蛋白，这些蛋白促进染色质聚集并阻止转录因子的结合。有研究[12]报道，CC中ING4 mRNA 的表达水平明显低于正常CC旁组织。ING4 可能通过抑制细胞生长，抑制肿瘤血管增生等途径抑制肿瘤的生长。

ING4是具有249个氨基酸的生长抑制剂(ING4)家族的成员，该氨基酸由位于12q13-31号染色体上的基因编码。 ING4包含3个核定位信号和1个高度保守的C端植物同源域(PHD)锌指基序。通过消减杂交筛选，最初将ING鉴定为肿瘤抑制候选物。 ING4在多种细胞过程中起重要作用，包括细胞增殖、细胞周期控制、细胞衰老和凋亡[13-14]。此外，已经证明ING4与组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)相互作用以调节基因转录。研究[15]表明，ING4与富含A-U的结合元件因子(AUF1)相互作用，从而下调原癌基因MYC。但是，仍需要阐明ING4对癌症进展的作用的分子机制。本研究检测了对照组和CC组织标本中ING4基因的甲基化模式。这些数据为本研究提供了一定的证据，CC组织中的ING4甲基化高于对照组，由此推测启动子区域的DNA甲基化可能影响CC发生过程中的基因激活。

为了验证ING4产生的表观遗传调控的假说，根据MSP状态评估，ING4启动子甲基化率为82.5%，对照组中甲基化率为12.0%，本研究表明CC组织中ING4 mRNA基因表达水平明显低于对照组。且发生甲基化组ING4 mRNA表达较未发生甲基化组低。这些数据表明，ING4基因启动子高甲基化状态可能是导致ING4 mRNA表达降低的一个原因，从而影响了CC的发生。尽管没有在这项研究中调查整个表观基因组，但很可能多个基因的表观遗传修饰参与CC发生发展。

本研究结果显示ING4基因启动子区的甲基化与CC患者的年龄、淋巴结状态、病理学分类和CC的临床分期等无明显关联。但是ING4基因启动子区甲基化表现出与ING4较低表达的显著相关性。在后续的研究中，加大样本量，同时进一步研究更多细胞因子的甲基化状态，以确定它们的甲基化状态与CC发生之间的关系。此外，还需要认识到ING4基因在CC的发生、发展和治疗反应中所起的关键作用。