脓毒血症患者急性肺损伤的差异基因表达分析

2020-10-12余彪闫志国干尧鳘

国际呼吸杂志 2020年18期

余彪闫志国干尧鳘

1四川大学华西医院眉山医院眉山市人民医院急诊科620010;2昆明市第一人民医院胸外科650011

脓毒血症作为临床医学较为常见的疾病之一,是一种由感染诱发的一系列病理、生理以及生化异常的综合征。其发病原因可能与下列因素有关:常发生于患有严重疾病或外伤的患者 (如严重烧伤、多发伤、外科手术后以及重症肺炎等患者),还可常见于伴有慢性病或免疫力低下者(如糖尿病、白血病以及再生障碍性贫血等)[1-2]。寒战、高热、咳嗽、胸痛以及意识障碍等是脓毒血症的主要临床表现,部分患者还会伴有水电解质紊乱、应激性溃疡、酸碱平衡失调等病症[3-4]。脓毒血症的发病机制较为复杂,是从分子水平到器官水平多因素相互作用形成的结果,其发病机制可能为:(1)病原体的外源性因子和损伤细胞释放的内源性因子均可与机体的模式识别受体相互作用;(2)脓毒血症炎症与凝血的相互影响;(3)免疫细胞的自我程序性死亡;(4)机体在受到感染刺激后大量炎性介质的释放。有明确的感染病灶、存在组织灌注不良表现(如急性意识障碍等)、降钙素原以及反应蛋白超过正常值2个标准差等是其主要诊断依据。脓毒血症严重时可导致器官功能障碍或循环障碍,危及生命安全,常伴有急性肺损伤 (acute lung injury,ALI),其预后效果较差,具有高病死率等特点[5]。随着生活、交通方式的快速转变,脓毒血症合并ALI的发病率及病死率呈现逐年上升的趋势[6],严重威胁着人们的身心健康,因此积极寻求一种有效治疗脓毒血症合并ALI的方式尤为重要。近年来,我国现代生物信息技术的快速发展 (如基因芯片等)为全面研究脓毒血症合并ALI发病机制提供了新的技术手段[7-9]。因此,本研究借助生物信息学对脓毒血症合并ALI的差异基因进行探讨。

1 材料与方法

1.1 一般资料本文患者资料来源为美国国立生物技术信息中心公共数据库,患者为匹兹堡大学医学中心ICU 中的13 例脓毒血症合并ALI患者和21例单纯脓毒血症患者。每例患者入院后48 h内取全血,提取RNA 进行基因表达谱分析和比较分析。

1.2 基因芯片GSE10474数据集的下载本研究首先从美国国立生物技术信息中心公共数据平台GEO 下载基因芯片GSE10474 数据集,其中包括13例脓毒血症合并ALI患者和21例单纯脓毒血症患者,下载完成后借助limma包对上述所查询出的数据进行标准化处理。

1.3 差异靶点基因的筛选及其数据处理为筛选脓毒血症和ALI的有效靶点基因,本研究利用贝叶斯算法对2组数据进行差异分析。设置差异的条件如下:logFC 绝对值＞0.5,P ＜0.05,所得出的差异基因用火山图进行可视化处理。为了明确前10个差异基因的表达情况,本研究结合样本表达量进行组间T 检验对其进行分析。

1.4 GO 富集及KEGG 通路的分析借助R 的ClusterProfile包对前10个差异基因进行GO 富集分析(主要用于注释差异基因的生物学过程)以及KEGG 通路的分析 (主要用于了解其相关的信号通路)。

1.5 差异基因的蛋白互作网络以及网络中核心驱动基因的分析将上述得到的差异基因使用string数据库对其进行处理,设置可信度为0.4,则认为具有统计学差异,之后便得出蛋白质相互作用的网络图,借助cytoscape软件筛选出核心驱动基因,并对其进行可视化图形处理。

2 结果

2.1 GSE10474数据集中2组数据标准化前后结果的对比结果显示,在进行标准化之前,数据基线较为紊乱;而在进行标准化之后,所有数据基线基本趋于一致。见图1。

2.2 差异基因的筛选及其数据处理结果本研究共筛选出73个差异基因,其中45个为上调基因,28个为下调基因,并对其进行可视化处理(图2)。前10个差异基因的结果如表1所示,上调基因分别为BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1 以及H4FH,下调基因分别为 CYBRD1、HOPX、UPB1、NME8以及FAR2。结果显示,前10个差异基因在2组中的表达差异有统计学意义(图3)。

2.3 差异基因GO 富集及其KEGG 通路的分析结果对差异基因进行了GO 富集分析后,可见这些差异基因主要富集在反式高尔基网络膜、细胞膜腔侧以及IRE1 介导的未折叠蛋白反应等 (表2);KEGG 通路分析显示主要集中的信号有3 条,即ZAP-70酪氨酸激酶、CD3和TCR Zeta链的磷酸化以及PD-1信号通路(表3)。

2.4 差异基因的蛋白互作网络分析结果为查找脓毒血症合并ALI相关的核心驱动基因,本研究构建了差异基因蛋白的互作网络。结果显示,共构建34个节点 (图4),其核心驱动基因共构建10个节点 (图5),按照互作关系从多到少的原则,初步确定了FCGR2B、HLA-DQB1、HLA-DRA、CD74、CD86、CD4、SEC31A 这7 个基因,这7个基因与其他基因存在较强的互作关系。

3 讨论

图1 34个样本数据标准化前后结果的对比 A:标准化之前;B:标准化之后

表1 前10个差异基因

图2 差异基因可视化处理 (火山图)

脓毒血症是由感染因素所引起的全身反应综合征,又是严重创伤、烧伤、感染以及外科大手术等常见的并发症,按其严重程度可分为脓毒血症、严重脓毒血症和脓毒血症休克[9]。脓毒血症患者若未得到及时治疗,不仅严重影响患者的生活水平,与此同时还会增加其心理负担。目前在临床工作中,该病的治疗方式主要为药物治疗及其他治疗(如抗休克治疗等),该病具有高发病率、高病死率以及预后较差等特点[10-11]。生物信息学是生物学、计算机科学以及信息工程等所形成的一门综合性学科,主要是应用生物算法和相关的软件工具采集、处理、分析和解释生物数据,利用生物信息学可有效挖掘在疾病发展进程中发挥作用的核心驱动基因,这为疾病发病机制的研究指明了方向[12-13]。脓毒血症合并ALI作为临床中的常见病,近年来很多学者对其进行了多种药物治疗的研究,但仍没取得理想的治疗效果且其发病尚未被阐明[14]。脓毒血症患者由于感染原因,容易导致肺功能降低和气体交换失衡,从而导致ALI,为进一步揭示脓毒血症合并ALI的发病机制提供新的方向。本研究利用生物信息学筛选与疾病相关的基因,为寻找该病治疗的新靶点提供一定的理论支持。在本研究中,上调基因分别为BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1以及H4FH。B7家族分子在调节免疫应答中的作用已得到充分证明,B7 家族中的BTNL8 可在体外增加T 淋巴细胞产生的细胞因子。有研究表明BTNL8可能在T 淋巴细胞的初次启动中起着重要作用,可共同刺激初次免疫反应[15]。CDKN1A 是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A,有研究表明在肺损伤大鼠模型中,CDKN1A 表达上调[16]。TREM1是一种新型炎症激发受体,是已知的炎症放大器。有研究表明,在肺组织中TREM1通过增强Ki-67、PCNA 和Ang-1蛋白表达,提高肺的修复能力,对肺损伤模型显示有益[17]。TAK1是一种激酶,与有丝分裂激活的蛋白激酶信号传导途径有关,是许多信号通路中的关键节点,对免疫反应起着至关重要的作用。Cheng等[18]在对小鼠进行支气管肺泡灌洗后,提取了小鼠原代巨噬细胞建立TAK1敲除模型,研究结果表明巨噬细胞中TAK1可能是肺炎的触发因素。H4FH 即Official Symbol的H4C8,有研究表明,H4C8具有提高人源化抗体的免疫原性,并且对人类是安全的、耐受性良好的[19]。CYBRD1是一种在十二指肠表皮细胞中高表达的靶基因,具有调节铁元素的吸收、促进细胞的损伤修复的功能。孟必成等[20]的研究表明,CYBRD1下调对小鼠模型具有促进修复的作用。HOPX 基因是一种磷酸组蛋白,在肺泡细胞代偿性再生长的过程中,可增殖双向分化形成新的肺泡,HOPX 是肺发育的重要调节剂,肺泡细胞损伤后,HOPX 分化Ⅰ型成熟的上皮肺泡细胞,并自我更新产生成熟的Ⅱ型上皮肺泡细胞,对肺组织的修复具有可塑作用[21]。

图3 前10个差异基因的表达情况 A:BTNL8表达;B:CDKN1A 表达;C:TREM1表达;D:TAK1表达;E:H4FH 表达;F:CYBRD1表达;G:HOPX 表达;H:UPB1表达;I:NME8表达;J:FAR2表达

在本研究中,通过对13例脓毒血症合并ALI患者和21例脓毒血症患者数据进行标准化处理,其结果显示与标准化处理前比较,2组的基线基本趋于一致,对2组数据共筛选出73个差异基因,包括45个上调基因和28个下调基因,前10个差异基因分布中,BTNL8、CDKN1A、TREM1、TAK1、H4FH 为上调基因,CYBRD1、HOPX、UPB1、NME8、FAR2为下调基因,且上述差异基因在脓毒血症患者和脓毒血症合并ALI患者中的表达差异有统计学意义。GO 富集分析可见这些差异基因主要富集在反式高尔基网络膜、细胞膜腔侧以及IRE1介导的未折叠蛋白反应中。KEGG 分析其通路信号有3条,即ZAP-70酪氨酸激酶、CD3和TCR Zeta 链的磷酸化以及PD-1 信号通路。string数据库和cytoscape软件分析发现FCGR2B、HLA-DQB1、HLA-DRA、CD74、CD86、CD4、SEC31A 与其他基因存在较强的互作关系。