体外培养GFP 裸小鼠颅骨细胞的表形分析

闫 可,吴从严,戴纯刚,赵海峰,王为华,赵耀东∗,朱文昱∗,黄 强

(1.南京医科大学附属苏州科技城医院 神经外科,江苏 苏州 215153;2.南京医科大学上海市第一人民医院 神经外科,上海 200080;3.南京医科大学附属苏州科技城医院 病理科,江苏 苏州 215153;4.苏州大学附属第二医院 神经外科,江苏 苏州 215004)

转绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP)基因的近交系裸小鼠(GFP 裸小鼠)是由苏州大学黄强课题组研发的[1],已在脑胶质瘤移植实验中发现, GFP 裸小鼠的脑组织和细胞因高表达GFP, 在示踪宿主源性肿瘤微环境( Tumor microenvironment,TME) 方面,不需要加荧光示踪剂而能直接起到清楚的示踪作用[2-7],能很好地证明TME 中的巨噬细胞,树突状细胞,少突胶质细胞和血管内皮等细胞,在变成肿瘤相关细胞的过程中,通过细胞融合而恶变,重构成更加异质的TME;但在我们正在进行的颅骨成形研究的GFP 裸小鼠骨细胞中,是否也能在示踪新骨形成方面起重要作用仍是未知。 本文提出这个问题,是由于发现GFP 新生裸小鼠的颅骨细胞,在短期培养中,见到成骨前体细胞有强大的扩增和分化能力,除了能在荧光显微镜下定性GFP 的局部位置和荧光强弱,还能在拉曼/ 多光子显微镜下进行量化,有望为下一步用于颅骨成形研究中对成骨和破骨细胞进行甄别和调控。

1 材料和方法

1.1 实验动物

出生后3 d 的GFP 裸小鼠( Foxn1nu.B6-CAGEGFP / SU,SPF 级)6 只,无关性别,体重约3 g,购自并饲养在苏州大学实验动物中心[SCXK(苏)2018-0006][ SYXK(苏)2017-0043],本实验经苏州科技城医院医学伦理委员会批准(IRB2018019),并严格遵循 “3R” 原则给与人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

细胞培养箱(MCO-18AC,Sanyo 日本);倒置显微镜( CKX41, Olympus 日本), 荧光显微镜( DM2500, Leica 德国); BMP-6 抗体( AB15640,abcam);CD11c 抗体(AF1396,碧云天);CD68 抗体( GK600710, 基因科技); CD206 抗体( 141711,BioLegend);DAB 试剂盒( GK347010,基因科技);RPIM1640 培养基( AE26543277,HyClone);离心机( TDZ5-WS, BIORIDGE ); RPIM1640 培养基(AE26543277,HyClone);胎牛血清(1616756,BI);青/ 链霉素(15140163,gibco);细胞培养板(corning,60 mm);12 孔细胞培养板(corning);15 mL 离心管(corning);移液枪(Thermo);超净台(苏州净化)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养方法

参照陈洁等[8]的方法,加以改良,简要过程如下:(1)乳鼠脱颈处死,75%乙醇消毒全身,置于超净台上,剪开颈背及头顶皮肤,取双侧顶骨,保留骨膜,放入含有青/ 链霉素的PBS 溶液中,剪成1 mm2大小的骨片,直接接种于含有10%胎牛血清及青/链霉素的RPMI1640 培养基中,在5% CO2培养箱中培养;(2) 待细胞移行出骨片贴培养皿壁生长后用消毒镊子夹出骨片,继续培养到布满皿壁90%时,用0.25% 胰酶消化3 min,得到原代培养细胞P0;(3)P0 按1 ∶1传代,每3 d 换液1 次,待细胞长满90%时,收获到的细胞为P1;(4)P2 参照P1 培养和收集。 P0,P1 和P2 均在液氮中保存备用。

1.3.2 细胞免疫化学染色

被检细胞放入加有圆形载玻片的12 孔板内,待细胞爬满玻片后,用PBS 润洗3 次,4%多聚甲醛溶液室温固定20 min,后续简要过程如下:(1) 0.5%TritonX-100 室温通透20 min,PBS 清洗三次。 (2)3%过氧化氢溶液清除内源性过氧化物酶,室温15 min,PBS 清洗。 (3)10%山羊血清室温封闭30 min。(4)吸出血清,孵一抗,4℃过夜。 (抗体工作浓度:BMP-6,1 ∶200;CD11C,1 ∶150;CD68,1 ∶100;CD206,1 ∶100)(5)PBS 冲洗3 次,室温孵二抗30 min,后用PBS 冲洗。 (6) DAB 光镜下显色2 ～5 min, 弃去DAB,PBS 冲洗数次。 (7) 苏木精染核15 s,自来水冲洗玻片。 (8)无水乙醇脱水3 min 共3 次,中性树胶封片。

2 结果

2.1 P0～P2 细胞和离体骨瓣状态

游离骨片置于培养皿底7 d,在骨片中央和边缘能见到细胞陆续移行出来,沿皿壁生长,随着培养时间延长,细胞数量不断增多,排裂紧,在低倍镜下呈鹅卵石样,在高倍镜下以长纤维和星形为主,白光和荧光镜下所见到的形态基本一致。 到6 ～8 d细胞布满皿底的90%时收获(P0),接着又继续传了二代(P1 和P2),传代时间分别为8 d 和15 d,如果再往下传,细胞生长趋势是越来越慢,因此结束细胞传代实验,并把收获的细胞于液氮冻存。

从细胞形态看,随着传代次数增多,向终末分化细胞增加,甚至老化会加重。 如果将取出的骨片继续培养(骨片传代),仍可见到细胞从骨片边缘移行出来继续生长,说明培养液中存放的离体骨片本身也是活着的,也可传代,但这属于类器官培养,难度更大,有待今后研究。 详见图1。

2.2 标志蛋白表达

(1)骨形态发生蛋白(BMP-6)的免疫复合物为棕色,在镜下见阳性细胞散在分布于细胞群各处,所占比例不高(图2A 红箭头),但表形很有特征性,免疫复合物主要在细胞质,组成细胞骨架(图2A 黄箭头),也有些沉积于染色质(图2A 绿箭头)。 更具特征性的是在胞外也有沉积,跨越多个细胞核,容易误判在多核细胞中表达(图2A 蓝箭头);

(2)巨噬细胞甘露糖受体1(CD206) 的深棕色免疫复合物也只存在于细胞群中的少数细胞中,特征是只在细胞浆表达,复合物呈颗粒状(图2B);

(3)CD68 的表达与CD206 相似,但CD11c 未见表达(图2C 和图2D)。

3 讨论

3.1 对正常成骨细胞系的评价

这是指已具永生化潜能的细胞,就颅骨而言:有Kodama 等[9]和Sudo 等[10]分别于1981 和1983年报告了新生小鼠颅骨细胞体外连续传代培养至数十代,以碱性磷酸酶阳性表达,矿化细胞聚集,形成骨的雏形为建系标准; 其中Sudo 等[10]建立的MC3T3 细胞系至今已成为商品被广泛应用。 可是1997 年Nakayama 等[11]从p53 缺陷小鼠的颅骨中建立MMC2 细胞系时指出,在他之前的细胞系几乎都是反复传代,获得永生化基础上建立的,这种永生化与未检测的相关基因突变有关。 他报告的MMC2成骨细胞系的染色体已是异倍体,所幸小鼠致瘤试验阴性,他的结论是MMC2 的永生化,除了与p53缺陷相关,不排除还有其它异常基因参与。 2004年,Kadowaki 等[12]从新生的GFP 转基因小鼠的颅骨中分离出成骨细胞,连续传26 代后建立了自发绿色荧光的C3 细胞系,再通过腺病毒转染BMP-2 于C3 细胞,用于4 mm 直径圆形缺损颅骨的修补,在荧光镜下明确显示,荷BMP-2 的GFP+细胞是形成新骨的主体。 同样,除了通过荧光示踪更加直接证明C3 细胞的成骨作用,但C3 基因型是否有改变不得而知。 总之,永生化细胞系如果作为治疗的工具细胞,用于改善颅骨成形术的预后,应注意致癌事件的发生。

3.2 对短期培养的成骨细胞评价

这里指来自生长发育中的新生小鼠颅骨细胞,培养早期的扩增能力不亚于成骨细胞系,不存在致瘤性,用于细胞接种时,根据所处的环境可向不同方向分化,评价其优劣的标准是看这个群体中的前体细胞占有率和亚群细胞的类型。 从本文报告的结果来看(图2),至少有与骨再生高度相关的成骨前体细胞和巨噬细胞(macrophages,M) 两种亚群细胞标志蛋白阳性,不妨探讨一下潜在的研究价值。已知骨再生有膜内成骨和软骨内成骨,前者见于骨折间隙小的扁平骨,后者见于间隙大的长骨[13],无论那种,M 都必须参与修复[14-16]。 在修复初期,M的作用是吞噬骨折部位的坏死组织和细胞碎片,后期募集间充质干细胞和血管祖细胞[17],这种功能转变称 “极化”,炎症性M 又称为经典活化巨噬细胞(M1);在再生中激活的M 称选择性激活巨噬细胞(M2),M1 / M2 的出生地均在骨髓(M0),根据骨折当时建立稳态环境需要决定对M0 是否进行征集。本文检测到的CD68+细胞可定性为M1 细胞[18],同样CD206+细胞可定性为M2 细胞[19],结合还检测到的BMP-6+细胞可定性为成骨前体细胞[20]。 有鉴于此,本文的P0,P1 和P2 有望作为工具细胞用于骨缺损修复实验。 不得不指出的是, 代表M0 的CD11c+细胞[21]未被检测到,究其原因可能与骨片离体培养,脱离了机体的骨髓环境有关。

图1 新生小鼠颅骨细胞培养Note.A (naked eye), Mice skull fragments for osteocyte culture.B (inverted microscope), The white area around the bone plate showed that the bone cells began to proliferate.As the culture time increased, the proliferation area gradually expanded and extended from the bone plate to the bottom of the dish.C ( inverted microscope), Amplification of red B-frame was the bone cells cultured for 2 days.P0 ～P2 ( inverted microscope) is a continuous passage cell, P0 ( Zero generation), P1 ( First generation ), P2 ( Second generation ) They have good proliferators, and their cells are like pebble-like; The morphology of D, E and F cells under different multiples of fluorescence in the same field of vision.E and G were compared under the same multiple fluorescence to daylight.The two forms were basically the same, except that the cytoplasm of e showed more clearly, and in the case of further magnification, F could clearly show pseudo-foot and pseudo-filament.Figure 1 Culture of skull cells in newborn mice