miR-186 通过负调控Smad6 对胶质瘤细胞迁移和上皮间质转化的影响

刘 艳,许 路,邵阿末,曾金艳,杨国青

(1.无锡卫生高等职业技术学校,江苏 无锡 214028; 2.西安市中心医院病理科,西安 710003)

胶质瘤起源于脑神经胶质细胞,约占颅脑肿瘤的40% ～50%,该肿瘤弥漫浸润生长、侵袭性强。 临床上采取手术、放化疗结合的方法治疗,虽然取得一些进展,但预后整体不理想,复发率高、生存期短。 微小RNA( microRNA,miRNA) 是一种小分子单链RNA,不具有编码功能,长为20～25 个碱基, 序列高度保守。 研究表明miRNA的表达改变与多种肿瘤的进程密切有关,它们可能具有肿瘤激活和肿瘤抑制的功能[1-2]。 miR-186 在胶质瘤中表达降低,功能实验表明其具有抑癌作用[3]课题组前期研究表明miR-186 通过靶向调节Smad6 对脑胶质瘤细胞增殖有一定作用[4],但是否会影响到迁移和上皮间质转化尚不清楚,本研究对此进行探讨。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人脑胶质瘤细胞U251 细胞株购自中国科学院北京细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

培养基、青霉素、链霉素购自HyClone 公司;转染 试 剂 LipofectamineTM2000、 TRIzol 购 自 美 国Invitrogen 公司;DNA 聚合酶、MMLV 逆转录酶和缓冲体系购自Promaga 公司;dNTP 及相关引物均由北京生工生物工程有限公司合成;凝胶配置相关产品购自北京碧云天生物技术研究所; 血清购自Biological Industries 公司; E-cadherin、 Vimentin、 βactin 等抗体购自美国Abcam 公司;PDTC 为Sigma公司产品;PVDF 膜、化学发光底物ECL 来自美国Millipore 公司;HF160W 型水套式二氧化碳培养箱购自上海力申科学仪器有限公司; BioPhotometer plus 核酸蛋白测定仪购自Eppendorf 公司;电泳设备购自美国BIO-RAD 公司; FR-200A 凝胶分析系统购自上海普诺森生物科技有限公司; Lighter Cycler2.0 实时荧光定量PCR 扩增仪购自Roche 公司;PE9600PCR 扩增仪购自PE 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人脑胶质瘤细胞系U251 用含10%胎牛血清、青-链霉素混合液的DMEM 培养基进行培养,放于5% CO2、37℃的培养箱内传代培养,每天观察细胞生长情况,及时进行换液。 选生长状态良好的细胞作为实验用细胞。

1.3.2 实验分组和试剂转染

细胞分组为对照组(U251)、模拟物组(miR-186 mimics)、质粒组( pc-Smad6) 和共转染组( miR-186 mimics + pc-Smad6 )。 根据说明书制备miR-186 mimics 或pc-Smad6 和Lipofectamine TM2000 脂质体复合物。 实验组加入miR-186 mimcs 和( 或) pc-Smad6 脂质体复合物。

1.3.3 基因检测(RT-qPCR)

收集细胞,TRIzol 裂解、提取总RNA。 测定各组的总RNA 浓度,然后取适量总RNA 进行反转录,最后取cDNA 模板于反应体系中进行RT-qPCR。miRNA-186 上 游 引 物 5′-GCCGCCAAAGAATTCT CCTTT-3, 下 游 引 物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3;Smad6 上游引物5′-CTGGAGTTGTTGAGCAGCC-3′,下游 引 物5′-GTGCGTCTTTCTTGTTTTGTCC-3′; βactin 上 游 引 物5′-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3′,下游引物5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′扩增条件为94 ℃5 min,94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃40 s,共40 个循环。 重复3 次实验,收集数据,计算基因的相对表达量。

1.3.4 Western blot 检测各组细胞的蛋白

胰酶消化并收集四组细胞,PBS 清洗细胞数次,然后RIPA 裂解液裂解细胞,取上清液,BCA 法测各组蛋白浓度,每组取10 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳,然后并将其转移至PVDF 膜,用含有脱脂奶粉的TBST 封闭液封闭1 h,加入兔抗人多克隆抗体,4℃孵育过夜, TBST 洗膜3 遍,每次5 min,加入辣根过氧化物酶体HRP 标记的二抗24℃孵育2 h,TBST避光洗膜3 遍,每次15 min。 最后加发光夜于仪器中曝光拍照,计算蛋白的相对表达量。

1.3.5 划痕实验

将接种至6 孔板中,待细胞汇合至85%左右时,有20 μL 枪头划痕,PBS 洗去脱落的细胞,显微镜观察并拍照,24 h 后继续观察显微镜观察细胞的迁移情况并拍照。 计算细胞迁移率以判断细胞的迁移能力。 实验均重复3 次。

1.4 统计学方法

使用SPSS 20.0 软件进行统计学处理,数据采用平均数±标准差(¯x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-186 和Smad6 在正常星形胶质细胞和胶质瘤细胞U251 中的表达

如图1 所示,RT-qPCR 和Western blot 实验结果表明,与正常星形胶质细胞相比,miR-186 在胶质瘤细胞U251 中表达明显降低,而Smad6 的基因和蛋白表达水平均显著增高,两者呈反相关系。 该结果提示在胶质瘤细胞U251 中miR-186 可能发挥抑癌作用,而Smad6 则发挥的是促癌作用。

图1 RT-qPCR 和Western blot 检测细胞中miR-186 和Smad6 的表达Note.A/ B, Statistical analysis of gene expression.C, Protein bands.D, Statistical analysis of protein expression.Compared with normal glial cells, ∗P<0.05.Figure 1 RT-qPCR and Western blot detection of miR-186 and Smad6 expression in cells

2.2 转染miR-186 mimics 和(或)pc-Smad6 后,各组U251 细胞中Smad6 的表达变化

如图2 所示,本实验的RT-qPCR 和Western blot结果表明,将miR-186 mimics 转染入胶质瘤细胞U251 后,Smad6 的表达显著降低,而转染Smad6 质粒后,其表达水平明显升高。 与Smad6 质粒组相比,共转染miR-186 mimics 和Smad6 质粒组Smad6的表达显著降低。 该结果说明miR-186 可负向调控Smad6 的表达。

2.3 miR-186 调控Smad6 对胶质瘤细胞迁移的影响

图3 迁移实验显示, 与空白组相比, miR-186 mimics 组U251 细胞的迁移率明显降低, 而pc-Smad6 组的迁移率则显著升高(P<0.05);与Smad6质粒组相比,共转染miR-186 mimics 和Smad6 质粒组细胞迁移率显著升高(P<0.05)。 上述结果表明,miR-186 能抑制U251 细胞迁移的作用,这种作用可被Smad6 过表达所逆转。

2.4 miR-186 调控Smad6 对胶质瘤细胞EMT 的影响

由图4 可知,与对照组相比,miR-186 mimics 组上皮细胞黏附分子E-cadherin 的表达显著升高,而间质细胞黏附分子Vimentin 的表达水平显著降低(P<0.05)。 在pc-Smad6 组中两种分子的表达情况相反(P< 0.05 )。 与pc-Smad6 组相比, miR-186 mimics + pc-Smad6 组Vimentin 的表达水平明显降低,而E-cadherin 的表达水平显著升高。 由此可见,miR-186 过表达可通过作用于Smad6 改变细胞上皮间质转化相关蛋白E-cadherin 和Vimentin 的表达情况。

3 讨论

胶质瘤是起源于神经外胚层的肿瘤,浸润性生长、失控性增殖,恶性程度高,治疗难度大、易复发,其机制尚不明确[5-6]。 故从分子水平寻求治疗靶点是目前胶质瘤研究的重要方向之一。 miRNA 可通过调控某些重要基因的表达而影响肿瘤的发生、发展过程[7]。

图2 RT-qPCR 和Western blot 检测各组细胞中Smad6 的表达Note.A, Statistical analysis of gene expression.B, Protein bands.C, Statistical analysis of protein expression.Compared with the U251 group, ∗P<0.05.Compared with the pc-Smad6 group,#P<0.05.Figure 2 RT-qPCR and Western blot detection of Smad6 expression in each group cells

图3 划痕实验检测各组细胞的迁移情况Note.A, The migration figure.B, Migration rate statistics.Compared with the U251 group, ∗P < 0.05.Compared with the pc-Smad6 group.#P<0.05.Figure 3 Wound healing assay anylasis of cell migration

研究发现miR-186 在多种肿瘤中表达异常,某些报道表明该基因在个别肿瘤中高表达,发挥促癌基因的功能[8-9]。 但更多的研究报道显示miR-186在较多肿瘤中发挥的为抑癌基因的作用,其中miR-186 在胃癌中低表达, 与该肿瘤的进展与转移有关[10]。 miR-186 在胆管癌和乳腺癌中低表达,可通过靶向调节Twist1 的表达影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化[11-12]。 Niinuma 等[13]的研究表明miR-186 的表达下调与胃肠道间质瘤的转移复发有关。 Ruan 等[14]研究表明miR-186 在肺癌中发挥抑癌作用,通过靶向SIRT6 抑制肺癌进展。 另有研究表明该基因在胶质瘤中也是低表达,发挥抑癌功能,但是具体的机制并不明确[15]。

Smad6 基因位于15q21-22,属于抑制性Smad蛋白,可调控TGF-β(Transformation growth factor-β)信号通路。 TGF-β 具有促进血管生成、抑制免疫、和刺激细胞外基质形成等作用,故有利于肿瘤生长、扩散和转移[16]。 研究发现Smad6 在小细胞肺癌、肝癌中均存在表达增加的现象[17]。 本课题组前期研究表明Smad6 在胶质瘤细胞中亦高表达。 其表达增加受miRNA-186 直接调控,并影响了肿瘤细胞的增殖[4]。 但是否会影响胶质瘤细胞的迁移和上皮间质转化尚不明确,本研究对此进行证实。

图4 Western blot 检测各组细胞中Smad6 的表达Note.A, Protein bands.B / C, Statistical analysis of protein expression.Compared with the U251 group, ∗P<0.05.Compared with the pc-Smad6 group, #P<0.05.Figure 4 Western blot detection of Smad6 expression in each group cells

上皮间质转化是指上皮细胞向间质细胞转变,该变化可引起肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显增加[18-19],从而促进了恶性肿瘤的浸润生长和远处转移,降低了患者的生存质量甚至危及生命。 在上皮间质发生过程中,上皮细胞标志分子E-cadherin 等表达下降, 而间质细胞标志分子Vimentin、 Ncadherin 等的表达明显增加。 研究表明miRNA 可通过调控某些基因而影响恶性肿瘤的迁移和侵袭。如王小明等[20]研究表明miR-206 通过调节VEGFA对人肝癌细胞的侵袭和迁移具有抑制作用。 亦有研究表明miR-186 可调节靶基因而影响恶性肿瘤的侵袭转移及上皮间质转化的发生[11-12]。

本研究结果再次证实了在胶质瘤细胞U251中,miR-186 低表达,而Smad6 高表达,两者呈反向关系。 通过实验进一步验证了miR-186 过表达后,胶质瘤细胞的迁移能力降低,E-cadherin 表达降低,Vimentin 的表达升高, Smad6 的表达降低; 转染Smad6 质粒后, 胶质瘤细胞的迁移能力增强, Ecadherin 表达升高,而Vimentin 的表达降低;与转染质粒Smad6 组比,共转染miR-186 模拟物和质粒Smad6 组胶质瘤细胞的迁移能力降低,E-cadherin表达降低,Vimentin 的表达升高,Smad6 的表达亦降低。 故该结果表明miR-186 可通过调节Smad6 抑制细胞迁移,减弱上皮间质转化相关蛋白Vimentin 表达,增加E-cadherin 蛋白表达。 但miR-186 是否会结合其他靶基因共同调控胶质瘤的迁移与上皮间质转化目前尚不清楚,需要我们进一步的研究。