芦荟苷对糖尿病肾病大鼠NOX4 / ROS / p38 MAPK信号通路及足细胞功能的影响

马冰沁,钱唯韵,罗振国,汪良芝

(常州市第一人民医院 全科医学科,江苏 常州 213000)

糖尿病肾病( diabetic nephropathy,DN) 是高血糖引发的肾小球病变,若不及时干预,患者进展为终末期肾病[1],严重影响患者健康和生命安全。 DN中高血糖可引起机体发生氧化应激、细胞因子表达异常,肾组织炎症反应加剧、糖脂代谢发生紊乱等症状,目前主要采用降血糖降脂方法治疗DN[2-3],但无法从根本上抑制DN 疾病进展。 芦荟苷作为中药芦荟的主要成分,具有免疫调节、抗氧化、抗炎、降血糖等多种药理学作用,在脊髓缺血/ 再灌注大鼠模型中可抑制氧化应激和炎症反应实现对大鼠的保护作用[4],但芦荟苷对DN 的作用尚不明确。本研究采用高糖高脂、 链脲佐菌素( streptozocin,STZ)诱导建立DN 大鼠模型,探讨芦荟苷对DN 足细胞的影响,并初步探讨其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

63 只健康SD 大鼠,购自北京维通利华实验动物科技有限公司[ SCXK( 京) - 2018 - 0021],体重180～220 g,SPF 级。 实验动物在本院动物中心暂养[SYXK(京)-2017-0003],暂养期间均自由饮水饮食,温度(24±1)℃、(12 / 12) h(光照/ 黑暗) 常规饲养。 所有动物实验均经本院动物实验伦理委员会审核并批准(IACUC-2017-0151)遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

STZ(美国sigma 公司,货号:S0131);格列喹酮片(糖适平)(北京万辉双鹤药业有限责任公司,批准文号:国药准字H10940258);芦荟苷(成都德斯特生物科技有限公司,产品目录号:DL0097);白介素-1β( Interleukin-1β, IL-1β)、 肿 瘤 坏 死 因 子- α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒、一抗尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)、p38 丝裂原活化蛋白激酶( p38 mitogenactivated protein kinase, p38 MAPK)、 phospho-p38 MAPK、Nephrin、Podocin、GAPDH,二抗羊抗兔(美国abcam 公 司, 货 号 分 别 为: ab100768、 ab100785、ab133303、 ab170099、 ab4822、 ab227806、 ab181143、ab181602、ab96587); 超氧化 物歧化 酶( superoxide dismutase, SOD ) 活 性 检 测 试 剂 盒、 丙 二 醛(maleicdialdehyde, MDA) 试剂盒、 活性氧( reactive oxygen species,ROS) 检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司,货号分别为:S0103、S0131、S0033);血糖仪( 欧姆龙,型号:HGM-114);蛋白凝胶成像系统(上海天能科技有限公司,型号:5200)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药处理

参照文献[5]构建DN 大鼠模型,实验前检测每只大鼠尿蛋白、尿糖水平,均正常。 STZ 溶于0.1 mol/ L 柠檬酸盐缓冲液备用。 高糖高脂饲料(18%蔗糖、9%蛋黄粉、8%猪油、1%胆酸钠、64%基础饲料)饲养大鼠4 周,禁食12 h,各组腹腔注射40 mg /kg STZ,72 h 后采集尾静脉血,检测血糖水平,空腹血糖≥16.7 mmol/ L 则造模成功,55 只大鼠造模成功40 只,造模成功后随机分为模型组、阳性对照组、(低、中、高)剂量实验组,每组8 只;正常组饲喂基础饲料,腹腔注射等体积0.1 mol/ L 柠檬酸盐缓冲液。 阳性对照组根据人与动物体表面积和体重换算,大鼠灌胃9.45 mg /(kg·d) 糖适平;(低、中、高)剂量实验组分别灌胃10、20、40 mg /(kg·d)芦荟苷,正常组、模型组灌胃等体积蒸馏水,连续6 周。

1.3.2 样品采集

给药前与给药后均采集尾静脉血,部分用于检测血糖水平,部分室温静置2 h,3000 r/ min 离心10 min 收集血清,置于-20℃冰箱待用。 立即处死大鼠,摘取肾,部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80℃冰箱待用。

尾静脉血采血后用血糖仪检测空腹血糖水平。

1.3.3 ELISA 检测血清中IL-1β、TNF-α 水平

-20℃冰箱取出血清, 严格按照大鼠IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒说明检测血清中IL-1β、TNF-α水平。

1.3.4 HE 检测大鼠肾组织形态

4%多聚甲醛固定24 h,取出肾组织,切片(厚度:6 μm)后苏木精染色、乙醇伊红复染,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜拍照。

1.3.5 肾组织中SOD、MDA、ROS 检测

- 80℃冰箱取部分肾组织, 研磨充分, 按照SOD、MDA、ROS 试剂盒说明书步骤检测肾中SOD、MDA、ROS 水平。

1.3.6 蛋白免疫印迹检测肾组织中NOX4、 p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、Nephrin、Podocin 水平

-80℃冰箱中取出肾组织,每组称重50 mg,冰上研磨,蛋白提取试剂盒提取各组大鼠组织总蛋白,凝胶电泳分离蛋白,转至PVDF 膜上;5%脱脂奶粉封闭2 h; 分别加入一抗NOX4、 p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、 Nephrin、 Podocin、 GAPDH, 4℃孵育过夜;加入对应二抗,室温孵育1 h;化学发光法显影,凝胶成像系统对条带进行灰度分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析,计量数据均采用平均数±标准差(± s )表示,多组间比较行单因素方差分析,进一步两两比较行SNK-q 检验。 P<0.05,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芦荟苷对大鼠血糖的影响

给药前,与正常组相比,模型组、阳性对照组、(低、中、高) 剂量实验组空腹血糖水平升高( P <0.05)。 给药后,与正常组相比,模型组空腹血糖水平升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、(低、中、高)剂量实验组空腹血糖水平降低(P<0.05)。 与给药前相比,给药后阳性对照组、(低、中、高)剂量实验组空腹血糖水平降低(P<0.05)。 见表1。

2.2 芦荟苷对大鼠血清中IL-1β、TNF-α 的影响

与正常组相比,模型组血清中IL-1β、TNF-α 水平升高( P < 0.05); 与模型组相比, 阳性对照组、(低、中、高) 剂量实验组血清中IL-1β、TNF-α 水平降低(P<0.05)。 见表2。

2.3 芦荟苷对大鼠肾组织形态的影响

正常组肾组织形态正常,结构清晰,肾小球、肾小管形态规则,肾小球、肾小管管腔未见扩张;模型组肾小球肥大,系膜增厚和肾小球基底膜增厚,间质炎症浸润;阳性对照组肾小球肥大现象得到缓解,系膜轻度增厚,未发现炎症细胞浸润;(低、中)剂量实验组随着剂量增加,肾小球肥大现象逐渐缓解,肾小球系膜轻-中度增生,肾小管扩张;高剂量实验组与正常组肾组织结构类似。 见图1。

2.4 芦荟苷对大鼠肾组织中SOD、MDA、ROS 水平的影响

与正常组相比, 模型组肾组织中SOD 水平、SOD/ MDA 降低(P<0.05),肾组织中MDA、ROS 水平升高(P< 0.05); 与模型组相比, 阳性对照组、(低、中、高)剂量实验组肾组织中SOD 水平升高(P<0.05),MDA 水平降低(P< 0.05);阳性对照组、(中、高) 剂量实验组SOD/ MDA 升高(P< 0.05),ROS 水平降低(P<0.05)。 见表3。

2.5 芦荟苷对大鼠肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平的影响

与正常组相比, 模型组肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平降低(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、(中、高) 剂量实验组肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平升高(P<0.05)。 见图2。

2.6 芦荟苷对大鼠肾组织中NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK 蛋白水平的影响

与正常组相比, 模型组肾组织中 NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比, 高剂量肾组织中NOX4、 phospho-p38 MAPK 蛋白水平,阳性对照组、(低、中)剂量实验组肾组织中NOX4 蛋白水平降低(P<0.05)。 见图3。

3 讨论

DN 属一种糖尿病的慢性并发症,具有较高致残率,中国糖尿病患者达11.6%,20% ～25% 出现DN,最终发展成终末期肾病,导致肾功能出现不可逆损伤[6],发病机制复杂,受多因素影响。 本研究发现模型组较正常组空腹血糖水平升高,肾小球肥大,系膜增厚和肾小球基底膜增厚,间质炎症浸润,提示DN 可诱导肾器官出现组织病变,出现炎症从而加重DN。 芦荟苷是单子叶百合科植物提取物,主要成分为蒽醌类化合物,对肾病大鼠具有促进作用,可对STZ 诱导的DN 大鼠起缓解作用,可降低血清肌酐、血尿素氮、尿蛋白水平,但具体机制尚不明确[7-8]。 本研究发现芦荟苷可缓解DN 引发的肾组织损伤、足细胞损伤、炎症反应,降低血糖水平,并且随着剂量的增加,缓解作用逐渐增强。

表1 6 组大鼠给药前、给药后空腹血糖水平比较(± s, n= 8)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels before and after administration in 6 groups of rats

表1 6 组大鼠给药前、给药后空腹血糖水平比较(± s, n= 8)Table 1 Comparison of fasting blood glucose levels before and after administration in 6 groups of rats

注:与正常组相比,∗P<0.05;与模型组相比,#P<0.05;与给药前相比,△P<0.05。Note.Compared with the normal group, ∗P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Compared with before administration, △P<0.05.

组别Groups给药前(mmol/ L)Before administration给药后(mmol/ L)After administration正常组Normal Group 8.47±1.26 8.68±1.35模型组Model Group 26.88±3.82∗ 27.15±4.05∗阳性对照组Positive control group 27.56±3.14∗ 12.65±2.51#△低剂量实验组Low dose experimental group 28.12±3.86∗ 14.81±2.37#△中剂量实验组Medium dose experimental group 27.95±3.58∗ 10.36±1.68#△高剂量实验组High dose experimental group 28.36±4.06∗ 8.94±1.59#△F 21.326 65.517 P 0.000 0.000

表2 6 组大鼠血清中IL-1β、TNF-α 水平比较(± s, n= 8)Table 2 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in serum of 6 groups of rats

表2 6 组大鼠血清中IL-1β、TNF-α 水平比较(± s, n= 8)Table 2 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in serum of 6 groups of rats

注:与正常组比,∗P<0.05;与模型组相比,#P<0.05。Note.Compared with the normal group, ∗P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.

组别Groups IL-1β(ng/ L) TNF-α(ng/ L)正常组Normal Group 3.15±0.41 4.88±0.53模型组Model Group 10.15±1.25∗ 12.25±2.15∗阳性对照组Positive control group 4.21±0.53# 6.52±0.77#低剂量实验组Low dose experimental group 8.37±0.45# 8.42±0.95#中剂量实验组Medium dose experimental group 6.15±0.72# 6.18±0.52#高剂量实验组High dose experimental group 3.94±0.44# 4.48±0.56#F 126.093 56.694 P 0.000 0.000

图1 6 组大鼠肾组织形态变化Note.Black arrow a, Lumen of glomerular epithelial cells ( podocytes).Black arrow b, Lumen of renal tubular epithelial cells.G, Renal tubule.P, Proximal curved tubule.D, Distal curved tubule.Figure 1 Morphological changes of kidney tissue in 6 groups of rats

表3 6 组大鼠肾组织中SOD、MDA、ROS 水平比较(± s, n= 8)Table 3 Comparison of SOD, MDA, and ROS levels in kidney tissue of 6 groups

表3 6 组大鼠肾组织中SOD、MDA、ROS 水平比较(± s, n= 8)Table 3 Comparison of SOD, MDA, and ROS levels in kidney tissue of 6 groups

注:与正常组相比,∗P<0.05;与模型组相比,#P<0.05。Note.Compared with the normal group, ∗P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.

组别Groups SOD(U/ mL) MDA(μmol/ L) SOD/ MDA ROS(ng/ L)正常组Normal Group 23.15±3.57 38.75±5.56 0.61±0.18 360.15±46.82模型组Model Group 6.90±0.75∗ 125.82±24.33∗ 0.05±0.01∗ 475.66±54.86∗阳性对照组Positive control group 20.55±3.14# 46.15±7.32# 0.45±0.09# 400.68±53.15#低剂量实验组Low dose experimental group 14.52±2.32# 100.56±14.37# 0.14±0.03 425.61±43.15中剂量实验组Medium dose experimental group 16.33±2.14# 65.17±8.14# 0.26±0.06# 395.56±40.23#高剂量实验组High dose experimental group 20.38±2.62# 45.38±5.91# 0.45±0.08# 386.18±38.16#F 40.916 60.715 42.228 5.820 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图2 6 组肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平Note.A, Normal Group.B, Model Group.C, Positive control group.D, Low dose experimental group.E, Medium dose experimental group.F,High dose experimental group.Compared with the normal group, ∗P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Nephrin and Podocin protein levels in 6 groups of kidney tissue

图3 6 组肾组织中NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK 蛋白水平Note.A, Normal Group.B, Model Group.C, Positive control group.D, Low dose experimental group.E, Medium dose experimental group.F, High dose experimental group.Compared with the normal group, ∗P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05.Figure 3 NOX4、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK protein levels in 6 groups of kidney tissue

IL-1β、TNF-α 作为炎症因子,在DN 中研究广泛,DN 中糖代谢紊乱均可介导炎症细胞浸润促进IL-1β、TNF-α 表达,进一步诱导炎症细胞浸润,形成炎症循环,减缓炎症现象可缓解疾病[9-10]。 本研究发现,与正常组相比,模型组炎症因子IL-1β、TNF-α水平升高,机体炎症反应加剧,进一步诱导炎症细胞浸润,形成炎症循环加重疾病。 经芦荟苷治疗后血清中IL-1β、TNF-α 水平降低,提示芦荟苷可缓解高糖高脂、STZ 导致的炎症因子升高现象。

肾小球足细胞裂隙跨膜蛋白Nephrin、Podocin均为足细胞标记基因,其中Nephrin 是第一个被发现的裂隙跨膜蛋白,特定位于足细胞足突裂孔隔膜处,肾小管病变时数量减少诱导裂孔隔膜结构变化影响肾功能[11];Podocin 对于维持足细胞裂隙隔膜结构的完整性中相关蛋白复合体的结构和功能正常发挥起重要作用[12]。 抑制Nephrin、Podocin 表达可加重DN[13]。 本研究发现模型组较正常组肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平降低,与模型组相比,(中、高)剂量实验组肾组织中Nephrin、Podocin 蛋白水平升高,提示DN 大鼠肾组织中Nephrin、Podocin蛋白水平降低可能改变破坏足细胞裂隙隔膜结构,肾功能受到影响。 芦荟苷可减缓DN 诱导的Nephrin、Podocin 蛋白水平降低现象, 升高二者水平,从而保持足细胞裂隙跨膜蛋白的完整性,减轻肾功能损伤。

炎症反应诱发氧化应激,氧化应激是DN 发生的重要原因。 SOD 作为抗氧化系统重要一员,可清除氧自由基,其水平反映机体抗氧化能力;MDA 是ROS 与其他物质发生氧化反应时脂质过氧化物分解产物[14]。 SOD/ MDA 反映机体抗氧化应激程度。NOX 是催化生成ROS 的关键酶,肾组织中表达较高,存在于细胞核、线粒体、内质网中[15];糖尿病状态下NOX4 水平升高可诱导ROS 生成,减少NOX4水平可降低ROS 产生,抑制高糖诱导的成纤维细胞增殖和活化,从而抵抗糖尿病肾纤维化[16],正常情况下p38 MAPK 在肾组织中表达较少,ROS 刺激下,MAPK 激酶被激活,作用于p38 MAPK 残基,残基发生磷酸化后,p38 MAPK 发生活化,活化后的p38 MAPK 参与细胞生长、 分化及炎症、 氧化应激过程[17]。 足细胞损伤中p38 MAPK 发挥重要作用[18],抑制p38 MAPK 信号通路可减少巨噬细胞浸润和TNF-α、IL-6 表达,减轻肾组织炎症损伤[19]。抑制NOX4 活性可抑制ROS 活化,进而阻断p38 MAPK 磷酸化[20-21]。 本研究发现与正常组相比,模型组肾组织中NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白、ROS水平升高,SOD/ MDA 降低;DN 中可激活NOX4 水平,从而诱导ROS 产生,使p38 MAPK 激活,从而加速细胞浸润和炎症因子IL-1β、TNF-α 表达,促进肾组织、足细胞病变,加重炎症反应,加重疾病进程。与模型组相比, 高剂量实验组肾组织中NOX4、phospho-p38 MAPK 蛋白、ROS 水平降低,SOD/ MDA升高,提示芦荟苷可抑制NOX4 / ROS / p38 MAPK 信号通路,从而促进机体抗氧化作用,抑制细胞浸润和炎症反应,实现对DN 大鼠肾组织及足细胞的保护。

综上所述,芦荟苷可能通过抑制NOX4 / ROS /p38 MAPK 信号通路发挥抗炎和实现对足细胞的保护。 但芦荟苷成分复杂,亦可能通过别的通路实现对炎症、足细胞作用,且p38 MAPK 与足细胞裂隙跨膜蛋白的作用尚不明确,需进一步探讨。