孢悬液浓度和宿主体型大小对球孢白僵菌对松墨天牛幼虫的致病力的影响

郭 涵,刘柱东,孙江华,3,*

(1.中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京 100101; 2.中国科学院大学,北京 100049;3.中国科学院生物互作卓越创新中心,北京 100049)

松墨天牛Monochamusalternatus，别称松褐天牛，是重大森林植物检疫性病害——松萎蔫病致病因子松材线虫Bursaphelenchusxylophilus的主要媒介昆虫(Mamiya and Enda,1972;Linitetal.,1983;Togashi,1989)。该昆虫在国内分布于河北以南，西藏以东；南至广东，东至台湾；国外分布于日本、朝鲜、老挝、越南等国(杨宝君等,2003)。其寄主有马尾松、湿地松、卡锡松、黑松、云南松、火炬松等，也可危害雪松、冷杉、云杉和落叶松(赵锦年和应杰,1989;周冰颖,2018)。该天牛幼虫蛀食树干和枝条的韧皮部及木质部，破坏组织，影响水分、养分运输，严重危害松树。松材线虫，原产于北美地区，由松墨天牛携带传播扩散，后传播到日本、中国、韩国、墨西哥和葡萄牙等地，造成松树大量枯萎死亡(Linit,1989)。我国于1982年在南京中山陵的黑松上首次发现松材线虫(杨宝君等,2003)，30年来蔓延扩散至18个省588个县级行政区，最西抵达四川省凉山州，最北端在辽宁北部多个县区，并已入侵多个国家级风景名胜区，累计发生面积约6.5万公顷(http:∥www.forestry.gov.cn/main/3457/20190424/162731641935736.html)。松材线虫不能自行传播，必须借助媒介昆虫天牛进行传播扩散(Linit,1988)，因此，防治媒介昆虫松墨天牛，是防控松材线虫传播扩散的有效途径。

对松材线虫病的治理主要是通过直接防治松材线虫和间接防治松墨天牛(Kobayashietal.,1984;展茂魁等,2014)。目前采取的化学防治措施主要包括通过人工单株注干施药方式杀灭松材线虫和通过飞机空中施药和地面机械喷药杀灭松墨天牛(刘洪剑等,2007)。化学药剂会对环境产生污染，同时也会杀死大量昆虫天敌，并且林间施用不便，防治效果差，生物防治松墨天牛成为研究重点，除利用信息素进行大规模诱杀外，还可以利用昆虫天敌和病原真菌。如利用寄生天敌川硬皮肿腿蜂Sclerodermasichuanensis、花绒寄甲Dastarcushelophoroides和病原微生物白僵菌等防治天牛(崔永三,2011;杨远亮等,2013)。

球孢白僵菌Beauveriabassiana是自然界广泛存在的子囊菌类虫生真菌(Quesadaetal.,2014)。白僵菌可寄生鳞翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目等700多种昆虫，也因为其有广泛的寄主范围、较强的致病性和适应性等特点，成为了农林业害虫生物防治的最广泛使用的虫生真菌之一(季香云和杨长举,2003;高红等,2011)。致病机制是白僵菌通过孢子接触到虫体，产生芽管进入虫体，其代谢物质扰乱昆虫的角质层、细胞膜以及细胞核等细胞器的运作，导致昆虫因代谢紊乱而死亡(Guptaetal.,1994;Duanetal.,2017)。白僵菌是日本应用最广泛的真菌，自1991年日本日东电工发明了昆虫病原真菌的无纺布载体培养技术，日本便开始生产白僵菌无纺布条以应用于松墨天牛等生物的防治(王滨等,2003)。我国也针对白僵菌防治松墨天牛展开了一系列研究。例如，孙继美等(1997)和胡加付等(2006)先后筛选出对松墨天牛致病力高的菌株并应用于生产实践;刘洪剑等(2007,2009)尝试用媒介昆虫如管氏肿腿蜂Sclerodermaguan携带和添加增效剂等方法提高白僵菌对松墨天牛感染率，取得了一定的效果。目前对于利用白僵菌防治松墨天牛的研究内容主要包括优良菌株的筛选、侵染途径的优化、感染机制和应用(孙继美等,1997;胡加付等,2006;刘洪剑,2007,2009;詹伟军,2013;阳飞等,2014)。对于松墨天牛本身，如虫体大小，在利用白僵菌防治松墨天牛中产生的影响研究较少。本文探讨了不同浓度的白僵菌对松墨天牛的致病能力和松墨天牛幼虫虫体的大小对施菌作用的影响，旨在为利用白僵菌防治松墨天牛提供应用。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫和真菌

松墨天牛幼虫于2018年11月采自浙江富阳昌东村。每头天牛编号、称重和测量头壳宽后置于10 mL的塑料离心管单管饲养，喂食马尾松锯末粉为主的半人工饲料(马尾松锯木粉200 g，琼脂粉20 g，山梨酸1 g，对羟基苯甲酸2 g，抗坏血酸2 g，亚油酸12滴，水650 mL)，放置在4 ℃冰箱中长期保存备用，期间每3个月更换一次人工饲料。

球孢白僵菌为商用球孢白僵菌孢子粉(BotaniGard 22WP)，由中国科学院动物研究所邹振研究组提供。

1.2 球孢白僵菌对松墨天牛幼虫的致病力试验

1.2.1孢悬液浓度对球孢白僵菌致病力的影响：参照柳建定等(2012)和郭雅琦等(2015)的研究，将松墨天牛幼虫分为5龄，其中4龄幼虫头壳宽范围为2.2～3.0 mm，5龄幼虫头壳宽范围为3.0～4.5 mm。根据龄期与头壳宽的关系，选择头壳宽范围为2.2～3.0 mm的的幼虫，即4龄幼虫用于本试验。

本试验探究不同浓度的白僵菌孢悬液对松墨天牛幼虫适合度的影响，试验设置了6个处理:0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL浓度，其中对照(CK)为含0.5%吐温-80的无菌水。参照雷妍圆等(2010)的浸虫法，用含0.5%吐温-80的无菌水将白僵菌孢子粉配制成浓度为0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL的孢子悬浮液，用镊子将供试幼虫挑入菌液，浸渍10 s后挑出，幼虫置于吸水纸上吸去多余水分，每10头幼虫为1个重复，各处理重复3次。

松墨天牛4龄幼虫在用孢悬液处理后，与对照组一同置于25℃恒温培养箱内培养，逐日观察并记录天牛幼虫发病过程、死亡情况及白僵菌感染情况，统计校正死亡率和校正染菌率。当虫体颜色变深红后会逐渐僵硬，此时晃动养虫管而虫体不动时，即判定为死亡。在死亡后，虫体保湿培养，观察菌丝生长及产孢情况，挑片镜检并根据Dangi和Lim(2018)的描述方法提取虫体体表菌丝体进行分子鉴定以确认是否为白僵菌感染致死。

1.2.2宿主体型大小对白僵菌致病力的影响：研究一定浓度白僵菌对不同体型大小的松墨天牛幼虫的致病力。选用最佳感染浓度1×109孢子/mL，试验设置6个处理，测定松墨天牛幼虫的死亡率和染菌率。试验幼虫按大小分为100～150,200～220,300～320,400～420,500～520和600～650 mg/头6组，每组随机挑选30头(3个重复，每个重复10头幼虫)相应大小的天牛幼虫，用1×109孢子/mL浓度白僵菌孢悬液处理。松墨天牛幼虫在用孢悬液处理后，每天观察并记录天牛幼虫颜色变化、死亡情况及白僵菌感染情况，统计死亡率和染菌率。

1.3 数据分析

根据试验观察，运用Excel记录整理数据，数据分析采用统计软件SPSS 20.0。百分数数据在分析前进行了反正弦转换，然后利用K-S方法检验数据是否符合正态分布；如果数据符合正态分布，采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，运用Duncan氏多重比较不同浓度的球孢白僵菌孢悬液处理后松墨天牛幼虫的校正死亡率和染菌率的差异显著性以及同一浓度球孢白僵菌孢悬液处理后不同大小虫体松墨天牛幼虫的死亡率和染菌率的差异显著性；如果数据不符合正态分布或方差非齐性，采用非参数分析，用Kruskal-WallisH方法进行检验。

2 结果

2.1 接种球孢白僵菌后松墨天牛4龄幼虫的染菌发病过程

每天观察发现，接种1×105～1×109孢子/mL球孢白僵菌孢悬液后的松墨天牛幼虫起初正常扭动，充满活力；随后接菌天牛通常会行动缓慢，且表皮出现烧灼状伤口；最后幼虫死亡，虫体长菌。虫体长菌一般先从头部开始，逐渐蔓延全身，最后口部也会蔓延出菌丝(图1)。经高浓度菌液(1×107,1×108和1×109孢子/mL)处理的幼虫在染菌后出现的感染现象更为明显和快速，且通过分子鉴定确定 为白僵菌感染[Length:571;Expect:0.0;Identities:545/545(100%);Gaps:0/545 (0%)]。

图1 接种1×109孢子/mL球孢白僵菌孢悬液不同时间后松墨天牛4龄幼虫的感染症状Fig.1 Symptoms of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus infected by 1×109 conidia/mL Beauveria bassiana spore suspension for different days

2.2 不同浓度的球孢白僵菌孢悬液对松墨天牛4龄幼虫的致病力

2.2.1孢悬液浓度对幼虫死亡率的影响：各浓度的白僵菌孢悬液都可以成功侵染松墨天牛4龄幼虫，但是不同浓度间存在差异，表现为浓度越大，天牛幼虫死亡率越高(图2:A)。天牛幼虫第2天开始死亡，第6天为死亡高峰期。第1天接种0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL孢悬液的天牛幼虫的累计校正死亡率分别为0,0,0,6.67%,3.33%和10.00%，差异不显著(H4=5.721,P=0.221)。从第2天开始，天牛幼虫累计校正死亡率出现显著性差异，表现为孢子浓度越高，天牛幼虫死亡率越高(图2:A)。接菌第7天，接种1×107,1×108和1×109孢子/mL孢悬液的天牛幼虫的累计校正死亡率都达100.00%，而接种1×105孢子/mL孢悬液的天牛幼虫的累计校正死亡率仅为21.43%(H4=13.745,P<0.01)。试验结束时(15 d),0(CK),1×105,1×106,1×107,1×108和1×109孢子/mL各处理组累计校正死亡率分别为10.00%,53.33%,100.00%,100.00%,100.00%和100.00%(H4=13.796,P<0.01)。

2.2.2孢悬液浓度对幼虫染菌率的影响：接种不同浓度的球孢白僵菌后，松墨天牛4龄幼虫的染菌状况与染菌浓度和染菌时间有着密切的关系，浓度越大，幼虫累计校正染菌率越高(图2:B)。经处理的天牛幼虫从第2天开始长菌丝，从第4天开始累计校正染菌率开始出现显著性变化，1×105孢子/mL处理中天牛幼虫累计校正染菌率最低(图2:B)。试验结束时(第15天)，1×106～1×109孢子/mL组中幼虫累计校正染菌率都在85.00%以上，而最低浓度(1×105孢子/mL)处理下幼虫累计校正染菌率为20.00%，与对照(染菌率为0)间差异显著(F4,10=15.306,P<0.01)。

图2 不同球孢白僵菌接种浓度下松墨天牛4龄幼虫的累计校正死亡率(A)和染菌率(B)Fig.2 Accumulative corrected mortality rate (A) and infection rate (B) of the 4th instar larvae of Monochamus alternatus inoculated with different concentrations of Beauveria bassianaC1:1.0×105孢子/mL 1.0 × 105 Conidia/mL;C2:1.0×106孢子/mL 1.0 × 106 Conidia/mL;C3:1.0×107孢子/mL 1.0 × 107 Conidia/mL;C4:1.0×108孢子/mL 1.0 × 108 Conidia/mL;C5:1.0×109孢子/mL 1.0 × 109 Conidia/mL.统计检验采用单因素方差分析(ANOVA)和Kruskal-Wallis H检验Statistical tests used one-way analysis of variance (ANOVA) and Kruskal-Wallis H test.

2.3 松墨天牛幼虫体型大小对球孢白僵菌孢悬液致病力的影响

2.3.1体型大小对幼虫死亡率的影响：总体上看，在浓度为1×109孢子/mL的球孢白僵菌孢悬液的处理下，不同体型大小的松墨天牛幼虫的死亡率随体重的升高而明显增加(图3:A)。经球孢白僵菌处理的天牛幼虫第2天开始死亡，第2-10天期间，不同体型大小的天牛幼虫死亡率无显著差异(P>0.05);第20天时，体重较低的天牛幼虫(100～320 mg/头)死亡率较低，体重较高的天牛幼虫(400～650 mg/头)死亡率较高，两者差异显著(H5=12.860,P=0.025)(图3:A)。

图3 接种1×109孢子/mL球孢白僵菌后不同体型大小的松墨天牛幼虫的累计死亡率(A)和染菌率(B)Fig.3 Accumulative mortality rate (A) and infection rate (B) of Monochamus alternatus with different body size after inoculation with 1×109 conidia/mL of Beauveria bassiana统计检验采用单因素方差分析(ANOVA)和Kruskal-Wallis H检验。Statistical tests used one-way analysis of variance (ANOVA) and Kruskal-Wallis H test.

2.3.2体型大小对幼虫染菌率的影响：在浓度为1×109孢子/mL的球孢白僵菌孢悬液的处理下，不同体型大小的松墨天牛幼虫的染菌率随体重的升高而明显增加(图3:B)。在长菌的过程中，体型大的天牛幼虫相较于体型小的出现了更高的染菌率。天牛幼虫第3天体表开始出现菌丝，第6-20天，不同处理的天牛染菌率出现显著差异，表现为大个体天牛幼虫的染菌率显著比小个体天牛幼虫高(P<0.05)(图3:B)。试验结束(第20天)时，体型大小分别为100～150,200～220,300～320,400～420,500～520和600～650 mg/头的天牛幼虫染菌率分别为60.00%,63.33%,60.00%,86.67%,96.67%和100.00%(F5,12=8.521,P<0.01)。

3 讨论

本研究结果表明，球孢白僵菌孢悬液对松墨天牛幼虫具有良好活性，其效果与孢悬液的浓度和天牛幼虫的大小有关。通过对比不同浓度的孢悬液处理后松墨天牛4龄幼虫的死亡率和染菌率发现，接种较高浓度孢悬液对松墨天牛幼虫的致病力较强。浓度为1×109孢子/mL时对天牛幼虫的感染力最高，发病最快，表现为第3-5天出现死亡高峰，在第5-6天出现虫体长菌丝的高峰期(图2)。同时，在相同浓度(1×109孢子/mL)的球孢白僵菌孢悬液处理下，个体较大的松墨天牛幼虫的发病率显著高于个体较小的幼虫，在感染率上明显上升，约为其两倍(图3)。这些研究结果将为松墨天牛的治理提供思考。

许多研究表明，球孢白僵菌在森林病虫害防治中发挥着不可替代的作用。日本自20世纪90年代便开始生产白僵菌用于生物防治(王滨等,2003)，我国也在其后筛选出松墨天牛高致病力菌株并应用在生产实践中(孙继美等,1997)。然而，在实际应用中，白僵菌的防治效果受多方面因素的影响，如紫外线、雨水、温度、湿度、区域和天牛本身的钻蛀危害习性(Walsteadetal.,1970)，使得孢子较难进入树木坑道、侵染天牛幼虫。借助天敌昆虫携带白僵菌孢子，如管氏肿腿蜂，将白僵菌传入隐蔽性危害的松墨天牛幼虫的坑道内，进而侵染天牛，并且已有报道证实白僵菌和天敌联合施用的防治效果高于单一方法的防治效果(王功桂等,2004;刘洪剑等,2007)。根据白僵菌浓度越高，天牛幼虫发病越快、染菌率越高的特点，在利用白僵菌防治松墨天牛的过程中，对松墨天牛发生重灾区，建议选配1×109孢子/mL白僵菌快速高效地侵染松墨天牛幼虫，快速降低松墨天牛虫口密度，减轻天牛幼虫对松树韧皮的危害，保护松树的同时阻断松材线虫的传播。而对松墨天牛的一般发生区(松墨天牛的危害对松树不致死情况下)，可选配1×107孢子/mL白僵菌，持续侵染松墨天牛，将松墨天牛的虫口密度控制在经济阈值以下。此外，发病进度表明松墨天牛一旦染菌，通常在10 d内死亡，为林间白僵菌施用的频次提供指导。由于松墨天牛世代重叠，幼虫发育不整齐，每年的5-10月林间均有不同大小幼虫(郭雅琦等,2015)，建议利用白僵菌进行生物防治时，白僵菌的使用频次以半月为宜。

在使用球孢白僵菌防治松墨天牛中，除了考虑施菌的浓度和时间，还需考虑天牛体型的大小。本试验发现，松墨天牛幼虫的体型大小也影响球孢白僵菌的侵染效果，表现为个体大的天牛染菌率更高(图3)。通常认为试虫个体越大，对病菌的抗性越强，越不容易感病(詹伟君等,2013)。试验过程中观察发现，天牛幼虫在接种球孢白僵菌后，虫体扭动加剧，推测大个体天牛幼虫染菌率高的原因可能是天牛幼虫越大，扭动越不灵活，不能及时除去沾在体表的孢子，从而更容易被球孢白僵菌侵染。利用白僵菌对不同大小天牛的侵染差异特点，采用管氏肿腿蜂与白僵菌协同防治松墨天牛将是更好的策略。二者可以在时间上互补协同控害，肿腿蜂的寄生最佳时期为松墨天牛幼虫的2-3龄期(王功桂等,2004)，而白僵菌对高龄幼虫更有效；此外，前人研究表明管氏肿腿蜂和白僵菌可联合使用，不产生负影响(de la Rosaetal.,2000;刘洪剑等,2007)，为共同使用防治松墨天牛提供了依据。

本试验中，用不同浓度球孢白僵菌处理，松墨天牛幼虫在发病时间上会出现差异，呈现出浓度越大发病越早的趋势(图2)；对于不同体重的幼虫，受球孢白僵菌侵染后其发病时间也不同，呈现虫体越大发病越早的趋势(图3)。本试验中浓度的试验和体型大小的试验是相互独立的试验，但1×109孢子/mL孢子浓度在前后试验中表现出了致病力的差异，浓度试验中发病早，而体型大小试验中发病晚(图2和3)。分析原因，我们认为有两点值得商讨：其一，白僵菌的致病力可能存在季节性变化，在两个独立试验处理中，浓度试验在7月实施，而个体大小试验在次年1月实施，病原微生物致病力的季节性变化可能导致了前后试验结果的差异，如已有报道证实柠条根系中丛枝菌根真菌致病力呈季节性变化(刘永俊等,2009)；其二，白僵菌孢子致病力可能与白僵菌孢子粉保存的温度、保存的时间和方式有关系，随着保存时间加长，孢子的活性下降从而致病力降低(张力泉等,2019)。