纤维素酶果胶酶辅助提取西瓜番茄红素工艺优化

刘义庆，王春燕，胡思前

（1.江汉大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430056；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070；3.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250014）

西瓜是深受人们喜爱的夏季时令水果，具有清热解暑、生津止渴、利尿除烦之功效，营养丰富，食用安全，又有良好的保健作用，堪称“盛夏之王”[1]。据统计，2018 年我国西瓜种植面积约152 万hm2，年总产量约8 200 万t，约占我国瓜类作物种植面积的71.7%，是夏季消暑水果[2]。

番茄红素是西瓜中重要的生理活性物质，具有消除自由基、预防心血管疾病、降血糖、促进细胞间的连接与传导、防癌抗癌、提高免疫力等多种生理功能[3]，因此提取与制备番茄红素是人们研究的热点[4-6]。西瓜中番茄红素含量高，且无需加工就可直接被人体吸收，所以西瓜是番茄红素的良好来源[7]。西瓜中番茄红素的提取方法主要有有机溶剂浸提法[7]、酶辅助溶剂萃取法[8]、超声波辅助萃取法[9]、微波辅助萃取法[10]、微波超声联合辅助萃取法[11]等。其中，酶辅助提取应用较广泛，常用于色素及各类生物活性物质的提取。与其它提取方法相比，具有仪器简单、操作方便、成本低、投资少，提取效率高的特点[12-13]。虽然有酶法辅助提取番茄红素的报道，但酶辅助提取西瓜番茄红素的探索不够深入，特别是纤维素酶、果胶酶对西瓜果肉的酶解作用条件和两种酶的最佳用量比等值得作进一步研究。本文分析了纤维素酶、果胶酶对西瓜酶解作用的条件，通过试验确定了纤维素酶、果胶酶联合辅助提取西瓜番茄红素的酶用量比，并通过正交试验筛选出了复合酶联合辅助提取西瓜番茄红素的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西瓜品种为华欣，购于武汉郭徐岭菜市场。

纤维素酶（酶活50 000 U/g）、果胶酶（酶活30 000 U/g），上海如吉生物科技发展有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂；醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验室用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

722E 型可见光光度计，上海光谱仪器有限公司；JY3002 电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HH-2 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；PHS-2C 型精密酸度计，上海精科雷磁；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；电烘箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

西瓜洗净，去皮切块，绞碎，过滤除汁，向西瓜果肉中，加入适量甲醇浸泡脱水，避光静置4 h 后抽滤，将抽滤后的西瓜果肉置于干燥箱内，在60 ℃下低温干燥4 h后取出，密封贮于5 ℃冰箱中备用。

1.3.2 西瓜番茄红素最大吸收波长的确定

称取2 g 西瓜果肉样品，置于10 mL 带塞比色管中，加入10 mL 乙酸乙酯-丙酮混合溶剂（7：1，V/V），在室温下浸提1 h，取适量上层提取液在比色管中稀释定容至10 mL，用分光光度计测定西瓜番茄红素溶液的吸收光谱。

1.3.3 西瓜番茄红素提取试验方法

称取西瓜果肉样品5 g，置于100 mL 带塞锥形瓶中，加入一定量的酶，在一定温度和pH 条件下酶解一定时间，根据文献[9]，采用乙酸乙酯-丙酮为提取溶剂（7：1，V/V），加入25 mL 提取溶剂，提取一定时间。静置，取一定量上层提取液用提取剂稀释定容至10 mL，以提取剂作参比，用分光光度计测溶液吸光度，计算提取量。每个试验重复3 次，取平均值。

1.3.4 番茄红素提取率的确定

称取西瓜果肉样品5 g，置于100 mL 带塞锥形瓶中，加入25 mL 提取溶剂，重复提取3～5 次至提取完全，合并提取液，采用文献[14]的方法制作工作曲线，根据式（1）计算5 g 西瓜果肉样品含番茄红素的总质量，然后根据式（2）计算提取率。

式中，m0-番茄红素总质量，μg；c0-番茄红素的质量浓度，μg/mL；V0-定容的体积，mL；N0-稀释倍数；Y-提取率，%；m-提取液番茄红素的质量，μg；c-提取液中番茄红素的浓度，μg/mL；V-定容的体积，mL。

1.3.5 酶辅助提取单因素试验

称取若干份经预处理后的西瓜果肉样品于100 mL带塞锥形瓶中，每份5 g，分别研究酶用量、酶解温度、酶解时间和酸碱度对西瓜番茄红素提取率的影响。设置酶用量为西瓜果肉质量的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，酶解温度为35、40、45、50、55、60 ℃，酶作用pH 为3、4、5、6、7、8，酶解时间为1、2、3、4、5 h。每个试验重复3 次，取平均值。

1.3.6 单一酶与混合酶对西瓜番茄红素提取率的影响比较

称取9 份经预处理的西瓜果肉样品于100 mL 带塞锥形瓶中，每份5 g，分为3 组，分别试验纤维素酶、果胶酶、复合酶对西瓜番茄红素提取率的影响。复合酶的构成比例和用量根据1.3.5 的试验结果确定。固定酶解温度、溶液pH 和酶解时间，用提取剂提取，比较不同的加酶方案对西瓜番茄红素提取效率的影响。

1.3.7 酶辅助提取正交试验

影响酶法提取番茄红素的因素有酶添加量、酶解温度、溶液pH、酶解时间。为了比较各因素对提取率的影响程度，在单因素试验的基础上进行正交试验。

2 结果与分析

2.1 西瓜番茄红素的吸收光谱

西瓜番茄红素的吸收光谱见图1。由图1 可知，番茄红素在455、481 nm 处各有一个吸收峰，其中以481 nm处吸收强度最大，检测灵敏度最高。结合文献[9]报道，故选用481 nm 作为番茄红素含量的测定波长。

2.2 酶添加量对西瓜番茄红素提取率的影响

酶添加量对提取番茄红素的影响见图2。由图2 可知，随着纤维素酶添加量的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度先增加后减少，当纤维素酶的添加量为西瓜果肉质量的0.4%时，溶液的吸光度最大，提取效率最高，与其它比例的酶添加量相比具有显著性差异（P＜0.05）。因此，纤维素酶的最佳添加量为西瓜果肉质量的0.4%。

随着果胶酶添加量的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度先增加后减少，当果胶酶添加量为西瓜果肉质量的0.10%时，溶液的吸光度最大，提取效率最高，与其它比例酶添加量相比具有显著性差异（P＜0.05）。因此，果胶酶最佳添加量为西瓜果肉质量的0.1%。

2.3 酶解温度对西瓜番茄红素提取率的影响

酶解温度对番茄红素提取率的影响见图3。由图可知，从35 ℃开始，随着果胶酶酶解温度的升高，西瓜番茄红素提取液的吸光度先增加后减少，温度为50 ℃时吸光度最大，番茄红素的提取率最大，与其它温度下的提取率相比差异显著（P＜0.05）。因此，果胶酶的最佳作用温度为50 ℃。

随着温度的升高，经纤维素酶酶解作用的西瓜番茄红素提取液吸光度也呈先增加后下降的趋势。温度为55 ℃时，番茄红素提取液吸光度最大，提取率最高，与其它温度下的提取率相比差异显著（P＜0.05）。因此，纤维素酶的最佳作用温度为55 ℃。

2.4 酶作用时间对西瓜番茄红素提取率的影响

纤维素酶、果胶酶酶解时间对番茄红素提取率的影响见图4（见下页）。由图4 可知，随着纤维素酶作用时间的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度增加，作用时间为3 h 时，溶液的吸光度最大，提取率最高，与其它作用时间相比差异显著（P＜0.05）。继续增加酶作用时间，番茄红素提取率不变，因此，纤维素酶的最佳作用时间为3 h。

随着果胶酶作用时间的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度增加，果胶酶的作用时间为2 h 时，溶液的吸光度最大，提取率最高，与其它作用时间的提取率相比差异显著（P＜0.05）。继续增加酶作用时间，番茄红素提取率有所下降，所以果胶酶的最佳作用时间为2 h。

2.5 pH 值对西瓜番茄红素提取率的影响

溶液酸碱度对番茄红素提取率的影响见图5。由图5可知，随着纤维素酶酶解pH 的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度增加，纤维素酶的酶解pH 为5.0 时，溶液的吸光度最大，提取率最高，与其它pH 条件下的提取率相比差异显著（P＜0.05）。因此，纤维素酶的最佳酶解pH 为5.0。

随着果胶酶酶解pH 的增加，西瓜番茄红素提取液的吸光度增加，果胶酶的酶解pH 为4.0 时，溶液的吸光度最大，提取率最高，与其它pH 的提取相比差异显著（P＜0.05）。所以果胶酶的最佳酶解pH 为4.0。

2.6 混合酶组成比例及不同加酶方案对提取西瓜番茄红素提取率的影响比较

根据2.2 的试验结果确定质量比为4：1 的纤维素酶、果胶酶组成复合酶。单一酶和混合酶对提取番茄红素的影响见图6。由图6 可知，单一酶和混合酶均可使西瓜番茄红素的提取率增加，但不同的加酶方案对提取番茄红素的影响不同：添加0.10%果胶酶与不加酶相比可使溶液吸光度增加16.1%；添加0.40%的纤维素酶与不加酶相比可使溶液吸光度增加41.3%，而添加0.50%混合酶时提取番茄红素的效果最佳，可使溶液吸光度增加54.8%。

2.7 正交试验

根据单因素试验结果，添加0.50%的混合酶（果胶酶和纤维素酶质量比为1：4）时提取番茄红素的效果最佳。纤维素酶、果胶酶的最佳作用温度分别为55、50 ℃，纤维素酶的最佳作用时间为3 h，果胶酶的最佳作用时间为2 h，纤维素酶的最佳酶解pH 为5.0，果胶酶的最佳酶解pH 为4.0。因此，选择对西瓜番茄红素提取影响较大的四个因素，即混合酶量、酶解温度、酶解pH 和酶解时间，设计四因素四水平正交试验方案（见表1），以西瓜番茄红素提取率为衡量指标优化提取工艺。试验结果如表2 所示。

表1 酶法提取西瓜番茄红素正交试验设计Table 1 Orthogonal experiment design of enzymatic extraction of lycopene from watermelon

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test

由表2 可知，利用混合酶酶解提取番茄红素时，四因素的影响大小顺序为A＞C＞D＞B，可见酶添加量对提取西瓜番茄红素的影响最大，然后是pH 值，其次是反应时间，最后是温度。极差分析最佳组合为A3B3C2D2，所以酶解法提取西瓜番茄红素的最佳工艺为质量比4：1 的纤维素酶、果胶酶混合酶添加量0.6%，酶解温度55 ℃，酶解pH 值4.5，酶解时间2 h。

经验证，在此条件下西瓜番茄红素的提取率为91%，说明酶辅助法可以大幅度提高番茄红素的提取率。

3 结论

添加纤维素酶、果胶酶及由纤维素酶、果胶酶组成的混合酶对提取西瓜番茄红素均有显著性影响，以添加混合酶（纤维素酶、果胶酶质量比为4：1）时提取西瓜番茄红素的效果最佳。同时酶的添加量，酶解pH，酶解温度，酶解时间都对提取效率有直接明显作用。正交试验结果表明，混合酶酶解各影响因素的影响顺序为混合酶量＞酶解pH＞酶解时间＞酶解温度。混合酶酶解最佳工艺为加混合酶量0.6%，酶解温度55 ℃，酶解pH 值4.5，酶解时间2.0 h，此条件下西瓜番茄红素的提取率可达到91%。