基于“适应原样”作用的人参碳量子点胶体对小鼠抑瘤作用研究和抗COVID-19临床应用

张喜武，田莹莹，李秋晗，2，白玉峰，朱瑜，窦金金

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省康效中医药研究有限公司，黑龙江 哈尔滨 150040；3.哈尔滨成程生命与物质研究所，黑龙江 哈尔滨 150500；4.哈尔滨团簇现代中医健康服务有限公司，黑龙江 哈尔滨 150500；5.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有高度的传染性，除人与人传染外，更体现在机体脏腑之间的传染，最终导致多脏器受损甚至脏器衰竭，基于此,可运用五脏同补的中药或者方剂进行治疗，达到对症治疗的目的。人参为“百草之王”，是一种滋补强壮的药物，2015版《中国药典》记载，人参具有大补元气、生津固发、补脾益肺、安神益智等功效，《神农本草经》中记载，人参具有“主补五脏……除邪气……”的功效，如生脉散可用于新型冠状病毒肺炎恢复期治疗[1]。

G-CQDS是以人参根为原料，采用超音速对撞粉碎和光电碳化技术，制备成人参碳量子点胶体，因其碳化集聚可负载大量电荷，能够进一步提高人参“适应原样”作用。G-CQDS已在市场应用5年之多，具有较强抗肿瘤和提高免疫力作用，现已被黑龙江省科技厅列入创新产品目录。在疫情期间，积极响应国家号召，为多家社区免费赠送了大量的G-CQDS，旨在提高人体免疫力，降低被COVID-19传染的风险，依据使用跟踪表统计结果，目前使用该产品的人群中未有被COVID-19感染者。由于疫情等多因素限制，目前应用到COVID-19确诊患者仅有2例，分别为何某某(女，武汉人，被武汉市第四医院(古田医院)收治，连续服用6 d，核酸检测阴性出院)和李某某(男，武汉人，被武汉市中医医院收治，连续服用7 d，治愈出院)。

1 实验材料与仪器

1.1 材料

SPF级ICR小鼠90只，18～22 g，雄性，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物许可证号:SYXK(黑)2015-003。NCI-H1975肺癌细胞，由中国科学院干细胞库提供。

1.2 试药

G-CQDS溶液(生命波人参根饮液：201811190802，95 mL)，由哈尔滨团簇现代中医健康服务有限公司提供，吉非替尼(181101，0.25 g)，购自阿斯利康制药有限公司。

1.3 试剂及仪器

RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；双抗(美国Hyclone公司)；磷酸盐缓冲液PBS(北京Biotopped公司)；4%台盼蓝(北京雷根生物技术有限公司)；IL-6 、TNF-α酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；不锈钢数显卡尺(上海尺喜工量具有限公司)；低速离心机，型号：SC-04(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；二氧化碳培养箱，型号：HF90(上海力申科学仪器有限公司)；超净台，型号：BIOsafe12(上海力申科学仪器有限公司)；倒置显微镜，型号：CKX41SF(美国Philippines公司)。超音速对撞粉碎仪器(哈尔滨成程生命与物质研究所自制)，光电碳化仪器(哈尔滨成程生命与物质研究所自制)。

2 实验方法

2.1 动物模型复制

60只SPF级ICR雄性小鼠皮下注射接种细胞悬液0.1 mL，即每只小鼠接种细胞数为5×106个/只。空白对照组10只SPF级ICR雄性小鼠皮下注射PBS磷酸盐缓冲液 0.1 mL。

2.2 G-CQDS溶液制备与表征

将超音速对撞粉碎仪器氮气流速设置为600 m/s，超高速对撞1～2次，将人参根(≤5年生)瞬间粉碎成超细粉末。将粉末与水混合后在光电碳化仪器进行加热，温度为120 ℃，人参粉末和水的质量比为1∶10，加热时间为180 s，远红外线照射速度30/s，使其全部碳化分散于水中形成碳量子点胶体溶液。碳量子点颗粒通过JEM-2100型透射电镜进行观察，测定其外观形态和粒径大小。采用Nicolet 6700型傅立叶变换红外光谱仪测试光谱，评估碳量子点的光学性质，采用荧光光谱仪(F-7000)，测定荧光发射光谱图。

2.3 动物分组及给药

建模后小鼠随机分为G-CQDS治疗组、吉非替尼组、模型组，每组20只；空白组10只，G-CQDS预防组20只。G-CQDS治疗组以30倍浓缩(相当于人每天饮用24瓶)的饮液9.88 mL/(kg·d)灌胃；吉非替尼组0.032 5 g/(kg·d)灌胃；模型组、空白组以纯净水灌胃，灌胃剂量均为0.2 mL，连续灌胃18 d；G-CQDS预防组提前给药34 d，剂量同给药组，第35天皮下接种肺癌细胞悬液，继续给药。

2.4 考察指标

2.4.1 外观观察

观察各组小鼠健康状况、精神状态、食欲、运动、毛发、大便及肿瘤生长情况等。

2.4.2 肿瘤体积

每天测量肿瘤体积(TV),其中a为长径，b为短径，肿瘤体积计算公式为肿瘤体积=1/2ab2。

2.4.3 相对肿瘤增殖率

各组根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积RTV=Vt/V0，其中V0为分组给药前(即d0)的肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积。抑瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率(T/C)，即给药组RTV与模型对照组RTV比值的百分比，T/C>60%为无效，≤60%并经统计学处理P<0.05为有效。相对肿瘤增殖率=TRTV/CRTV×100%。

2.4.4 体质量、胸腺指数及脾指数

称量小鼠给药前(即d0)的体质量及最后一次给药后的体质量。最后一次给药后，禁食不禁水，次日将小鼠摘眼球取血，处死，解剖，剥离胸腺、脾脏，称重，计算胸腺指数及脾指数。胸腺指数=[小鼠胸腺重量(mg)/小鼠体质量(g)]×10；脾指数=[小鼠脾脏重量(mg)/小鼠体质量(g)]×10。

2.4.5 细胞因子IL-6、TNF-α

小鼠摘眼球取血，血静置1～2 h，离心，取血清,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每组小鼠血清中IL-6(白细胞介素6)，采用竞争法(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。

3 实验结果

3.1 G-CQDS的制备与表征结果

高分辨电镜照片显示碳颗粒为无内部缺陷的完整晶体，碳量子点呈类球形单分散，直径约为2～5 nm，见图1a。图1b为碳量子点的傅里叶红外光谱，图中3 439 cm-1处为羟基(-OH)的伸缩振动峰；2 923 cm-1与1443 cm-1处是C-H的特征吸收峰；1 725 cm-1处为C=O的伸缩振动峰；1 235 cm-1处的吸收峰表明存在C-O官能团；860 cm-1处表示存在C-C的伸缩振动；625 cm-1处表示可能有C-CO-C弯曲振动。图1c为激发光波长不变情况下碳量子点的Emission Wavelength发射光谱，测定样品发射出不同波长的荧光，波长为横坐标，以其强度F为纵坐标作图，325 nm激发波长下碳原子团簇/纳米碳的荧光光谱，在325 nm激发波长下的荧光最大发射波长约为440 nm。图1d为保持荧光发射波长不变碳原子团簇/纳米碳Excitation Wavelength激发光谱，400 nm发射波长下纳米颗粒的激发光谱，在400 nm发射波长下最大激发波长约为470 nm，说明纳米颗粒表面含有较多-OH和-COOH。

图1 a为采用水热法制备的G-CQDS透射电镜照片;b为石墨脉冲激光辐照制备的人参碳碳量子点胶体红外吸收光谱(傅里叶红外光谱);c为水热法法制备的G-CQDS Emission Wavelength发射光谱;d为水热法制备G-CQDS Excitation Wavelength激发光谱

3.2 外观观察结果

观察小鼠外观及生存状态，G-CQDS治疗组及预防组较模型组瘤体小，活泼好动，精神状态良好，食欲良好，毛发光泽，大便性状未见异常；吉非替尼组小鼠瘤体小，行动迟缓、不活泼，食欲欠佳，毛发暗淡无光泽；模型组与给药组相比，瘤体较大；空白组小鼠健康状况及精神状态良好，食欲佳，行动灵活。

3.3 肿瘤体积(TV)结果

表1 各实验组小鼠肿瘤体积

各组小鼠肿瘤体积如表1所示，吉非替尼和G-CQDS治疗组肿瘤体积较模型组显著减小，随着给药天数的增加，肿瘤体积先增大后减小。建模小鼠成瘤率100%，G-CQDS预防组小鼠成瘤率为35%。

3.4 相对肿瘤增殖率(T/C)结果

表2 各实验组小鼠相对肿瘤增殖率的影响

G-CQDS治疗组给药10～13 d的相对肿瘤增殖率分别为57.24%、55.00%、28.14%、17.93%，均<60%，吉非替尼组给药第13天相对肿瘤增殖率达到38.65%。见表2。

3.5 体质量、胸腺指数及脾指数结果

小鼠给药前后体质量的变化如表3所示，G-CQDS治疗组体质量增长量与模型组一致，说明G-CQDS对小鼠体质量无影响；吉非替尼组体质量变化比模型组小，可能与吉非替尼影响小鼠食欲有关；G-CQDS预防组体质量变化大，原因可能与给药周期较长有关。

表3 各实验组小鼠体质量、胸腺指数、脾指数的影响

小鼠胸腺指数、脾指数的测定如表3所示，吉非替尼组较模型组明显降低胸腺指数和脾指数，其中脾指数更为显著；G-CQDS治疗组对小鼠脾指数的影响较大，G-CQDS预防组与模型组比较均能降低胸腺指数和脾指数(P<0.01)。

3.6 细胞因子IL-6、TNF-α检测结果

表4 各实验组小鼠IL-6、TNF-α的影响

试剂盒检测结果显示，G-CQDS预防组可以显著降低IL-6的含量，吉非替尼、G-CQDS治疗组及预防组与模型组比较均可升高TNF-α的含量，从而达到抑制肿瘤生长的作用。见表4。

4 结论

G-CQDS治疗组与模型组比较肿瘤体积明显减小，给药第10天起相对肿瘤增殖率<60%，证明G-CQDS具有抗肿瘤作用，且起效速度较快。预防组成瘤率显著降低，且预防组显示出更好的疗效，证实G-CQDS可以有效预防肿瘤形成。能明显降低胸腺指数和脾指数，可能通过调节小鼠免疫功能达到抑制肿瘤生长的目的。G-CQDS治疗组与预防组对小鼠外观和生存状态无任何不良影响，而吉非替尼阳性对照组对模型小鼠外观和生存状态影响较大，推测是由吉非替尼副作用导致的[2-3]。

人参具有“适应原样”作用，能够增强机体对有害因素的抵抗力。临床中医专家认为患者热退后往往存在疲倦、舌少津等症状，表现为气阴两虚证，与众多专家意见相同[4]，提示新冠肺炎患者核酸检测阴性出院后，仍要继续服用人参产品，尽快恢复新冠肺炎对身体造成的损伤。

超音速对撞粉碎和光电碳化仪器是由哈尔滨成程生命与物质研究所和北京航空航天大学国家重点实验室合作自主研发并制造，其技术水平为国内领先，共耗资几千万元人民币。超音速对撞技术采用高压气体和高速离心加速，将中药粗颗粒以600 m/s的速度相向对撞，使其破碎成原子或分子团簇(小于5 mm)，悬浮在水溶液中。光电碳化技术是高压放电产生的等离子体(弧光或闪电)作用在悬浮于水溶液中的团簇，使其碳化制成碳量子点溶胶的过程(直径约为2～5 nm)。 碳量子点(CQDS)是近来出现碳纳米材料家族的新成员，由于其有荧光稳定性高且耐光漂白、激发光宽而连续、有水溶性好及在细胞中迁移快等特性，被认为是一种理想的生物医用材料[5]。最新研究发现碳量子点具有提高T细胞能力以及诱导人肝癌细胞、骨肉瘤细胞凋亡的现象[6-9]，将传统中药制备成以碳量子点形式给药，可大大能够提高临床疗效。