喜树碱与10-羟基喜树碱对5种植物的化感作用

范晓月, 何云核, 赵富荣, 郭 明,3

(1.浙江农林大学风景园林与建筑学院;2.林业与生物技术学院;3.理学院， 浙江 杭州 311300)

目前植物功能的开发多是基于美化环境的作用，相关研究工作也多是从视觉景观上加以考虑.而有些植物本身所释放的化学物质具有抑制周边植物生长的现象，即化感作用[1].因此，人们在注重观赏植物视觉效果的同时，开始将植物间的相互作用纳入园林观赏植物的生态应用配置中，使得植物的视觉景观感受与系统正常高效运行完美结合在园林绿化中.然而，虽然植物化感作用在农作物、杂草、藻类控制以及外来入侵物种等方面取得不少研究成果[2,3]，但在植物应用配置中的化感作用研究还不够全面.植物生态系统中，化感作用主要表现为植物对自然资源和生存空间的竞争，能够直接影响到系统结构的稳定和经济效益的实现[4].张淑珍等[5]研究表明，香樟对多种草坪草存在化感作用；Liu et al[6]研究表明，白桦、落叶松对其它植物种子萌发和苗生长具有化感作用；Chen et al[7]研究表明，杉木能够分泌化感物质.喜树(Camptothecaacuminata)为蓝果树科喜树属植物，是我国特有树种.喜树干形通直、树姿优美， 具有很高的观赏价值，适用于庭院绿化、城市绿地等[8,9]，是集观赏价值与药用价值于一体的园林植物，在生态景观植物配置中占有一定的地位.研究表明，喜树的主要化学成分之一是生物碱类物质[10,11]，具有一定的生物活性和化感作用，对多种人癌细胞株的生长有明显的抑制作用[12-16]，但在植物效应方面的研究尚未见报道，而研究植物化感物质对其它植物种子萌发及植株生长的影响有着重要的生态意义和广阔的应用前景[17].

现有研究中，植物化感作用的生理指标有叶片相对含水量(RWC)、叶片相对电导率、光合色素、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)和可溶性糖等，生长指标有发芽率、发芽指数(GI)、活力指数、幼苗苗高、幼苗根长、幼苗鲜重和叶面积等，光合荧光指标有光响应曲线、光合气体交换参数和叶绿素荧光参数等.本研究以白车轴草(Trifoliumrepens)、大吴风草(Farfugiumjaponicum)、三色堇(Violatricolor)、麦冬(Ophiopogonjaponicus)和鸢尾(Iristectorum)5种常见草本观赏植物为试材，探讨喜树碱与10-羟基喜树碱混合物对5种草本观赏植物种子萌发和幼苗生长生理指标的影响，从而了解喜树的化感效应及生理生化机制，为乔木与草本植物在园林景观中的合理配置提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

受体植物来自浙江农林大学东湖校区，选取长势一致、无病虫害的白车轴草、大吴风草 、三色堇、麦冬和鸢尾 5种草本观赏植物，移植于温室大棚，至植物经过缓苗期后开始试验，5种植物种子购自杭州万年青种业公司.

喜树碱与10-羟基喜树碱均购自萨恩化学技术(上海)有限公司，纯度99%.因两种物质均难溶于水，所以先将喜树碱与10-羟基喜树碱分别溶于少量的酒精，最后配成酒精含量为0.5%(体积分数)的溶液，按1∶1的体积混合处理5种植物，以含有0.5%酒精的蒸馏水为对照CK0.5，不含酒精的蒸馏水为对照CK0，5 mg·L-1浓度为处理1(T1)，10 mg·L-1浓度为处理2(T2)，20 mg·L-1浓度为处理3(T3)，40 mg·L-1浓度为处理4(T4)，均用蒸馏水配置试验所需溶液.

1.2 试验方法

采用培养皿种子萌发试验和盆栽试验，检测相关生长和生理指标，研究化感物质对5种草本植物的作用，从而考察5种植物对喜树碱与10-羟基喜树碱的耐受性.

1.2.1 种子萌发试验 种子萌发试验采用培养皿滤纸法，选取饱满、状态一致的种子，0.5% H2O2溶液消毒5 min，无菌蒸馏水清洗5次，吹干备用.在灭菌过的铺有两层定性滤纸的培养皿中，分别加入5 mL不同浓度的喜树碱和10-羟基喜树碱混合液(1∶1混合)，对照加等量无菌蒸馏水和含0.5%酒精的溶液.每个培养皿中播种50粒种子，各处理设置3次重复，置于25 ℃恒温光照培养箱中黑暗培养.播种24 h后开始记录发芽数(以胚根冲破种皮1～2 mm为发芽标准)，每天定时观察并记录发芽种子的数量，直至对照组种子的发芽数不再变化为止，计算发芽率、发芽指数.

发芽率、发芽指数计算公式如下，计算结果见表1.

表1 CPT和HCPT对5种受体植物种子萌发的影响1)

发芽率(GP)=(种子发芽数/供试种子总数)×100%

(1)

发芽指数(Gi)=∑Gt/Dt

(2)

其中，Gt为在第t天的发芽数，Dt为相应的天数.

化感效应指数(RI)=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T

综合化感效应指数(SE):供体植物对同一受体植物各个测试指标的RI的算术平均值[18].

1.2.2 幼苗生长试验 试验植物为长势大体一致的幼苗，种植于口径18 cm，高16 cm，底径13 cm的花盆里，用喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液(1∶1)处理5种植物，每个处理重复3次，每次共用200 mL混合液处理，每5 d处理1次，45 d后测定植物的相关生理指标，包括叶片相对电导率、叶绿素(Chl)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP).试验材料均于相同时间点取样，样品当天处理分析完毕.

植物相对电导率采用电导法测定，叶绿素含量采用浸提法测定，SOD酶活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定，POD 酶活性采用愈创木酚法测定，CAT活性采用紫外分光光度计测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，脯氨酸含量采用茚三酮溶液显色法测定，SP含量采用考马斯亮蓝法测定[19].

1.3 数据分析

所有试验均重复3次，结果以平均值±标准偏差表示，并经GraphPad、SPSS 16.0统计分析，P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 化感物质对5种植物发芽率的影响

统计种子萌发数、发芽指数和根长，根据CK0.5计算RI值，CK0仅作参考(表1).含有0.5%酒精的处理对植物种子萌发、发芽指数和根长的影响较小，基本可以忽略，而加了化感物质的处理液对种子萌发的抑制作用较强，进而可能会导致植株根系变小，吸水、吸肥能力降低.在5种受体植物中，种子萌发率的化感抑制作用随化感物质浓度增高而逐渐增强，具有剂量效应，但增幅不一致，其中不同浓度的化感物质在白车轴草、三色堇和鸢尾根系和种子萌发中抑制作用较明显(P<0.05)，在另外两种植物中抑制作用不显著.结合图1分析可知，化感综合效应敏感度为：白车轴草>三色堇>鸢尾>大吴风草>麦冬.

2.2 化感物质对5种植物叶片相对电导率的影响

种子萌发试验表明，含有0.5%酒精的处理对植物的影响可忽略，因而在植物生长指标中，将含有0.5%的酒精处理作为对照.叶片电导率可反映植物受伤害的程度，可用来分析植物的抗逆性强弱[20].

不同浓度的喜树碱与10-羟基喜树碱混合溶液处理后，植物叶片相对电导率随着药物浓度的增高显著大于CK0.5(图2).其中，麦冬、三色堇、鸢尾、白车轴草和大吴风草植物叶片相对电导率分别比CK0.5提高86.0%、78.1%、76.0%、56.2%和34.9%，表明化感物质对5种植物叶片细胞膜具有较高的损害，植物叶片细胞电解质外渗，使得细胞内外渗透压不平衡.

2.3 化感物质对5种植物叶片MDA含量的影响

检测结果表明，随着化感物质浓度的增高，植物叶片MDA含量呈上升趋势(图3)，且显著高于CK0.5(P<0.05)，麦冬、三色堇、白车轴草、鸢尾和大吴风草相较于CK0.5增幅分别为：285.7%、241.7%、183.3%、168.8%和118.2%.说明植物叶片细胞膜在喜树碱与10-羟基喜树碱共同作用下受到氧化作用，使膜脂过氧化终产物MDA大量积累，进而导致植物代谢紊乱.

2.4 化感物质对5种植物光合色素的影响

叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)是植物光合作用的主要色素，在植物体内的含量与植物光合作用效率密切相关.5种植物受到化感作用时，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素a+b含量的变化趋势相同(表2).其中，白车轴草、三色堇、麦冬、鸢尾和大吴风草的叶绿素a+b含量相较于CK0.5降幅分别为81.9%、77.3%、79.7%、61.1%和28.5%(P<0.05)，类胡萝卜素含量相较于CK0.5降幅分别为68.8%、68.3%、75%、48.8%和27.0%.以上结果表明，植物在化感作用下，叶绿体结构受损，叶绿素和类胡萝卜素大量分解，其原因可能是化感物质进入受体植物幼苗体内抑制了ATP酶的活性，使叶绿素合成的酶系统受到影响，也可能是化感物质引起植物体内活性氧的增加，致使叶绿素结构遭到破坏而趋向分解[21]，影响植物光合作用有效进行，最终降低植物配置的生态效益.

表2 化感物质对植物叶片光合色素的影响1)

2.5 化感物质对5种植物叶片SOD活性的影响

5种植物叶片的SOD活性随化感物质浓度的增高呈先上升后下降的趋势(图4).5种植物在作用浓度为10 mg·L-1时，SOD活性达到最大，其中有4种植物叶片的SOD最大活性均显著高于CK0.5(P<0.05)，鸢尾、三色堇、大吴风草和麦冬分别比CK0.5增高81.2%、56.4%、50.0%和27.5%，而白车轴草最大活性只比CK0.5高8.5%，表明化感作用促进了植物的SOD活性.根据SOD活性变化可以看出，5种植物受化感物质作用浓度影响显示出不同程度的变化，并在化感物质作用浓度超过10 mg·L-1后，所有植物的SOD活性均下降，这可能是因为5种草本植物受到的胁迫已超出自身抗氧化系统的极限，导致保护酶活性均降低.

2.6 化感物质对5种植物叶片POD活性的影响

5种植物叶片的POD活性随化感物质浓度的增高呈先上升后下降的趋势(图5).处理浓度为10 mg·L-1时，POD活性达到最大值，植物的最大POD活性显著高于CK0.5，三色堇、麦冬、鸢尾、大吴风草、白车轴草分别为CK0.5的174.4%、169.5%、168.5%、159.2%、136.6%.由此可见，化感作用能显著促进植物的POD活性.但化感物质浓度超过10 mg·L-1时，POD活性开始显著下降，说明植物的抗氧化系统是有一定限度的.

2.7 化感物质对5种植物叶片CAT活性的影响

5种植物叶片的CAT活性随化感物质浓度的增高呈先上升后下降的趋势(图6).同SOD、POD活性的检测结果相似，5种植物的CAT活性均在10 mg·L-1时达到最大值，最高CAT活性显著高于CK0.5，三色堇、大吴风草、鸢尾、麦冬、白车轴草分别为CK0.5的178.6%、169.7%、168.7%、167.7%和150.1%.表明化感物质作用后促进了CAT的活性，使得植物在逆境时启动自身防御系统，释放多种成分.本试验中，5种植物在受到10 mg·L-1化感物质作用时，CAT、SOD、POD活性达到最高值，保护植物在逆境条件下免受伤害，但研究发现，当化感作用超过这一浓度时，保护酶活性降低[22].

2.8 化感物质对5种植物叶片可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白(SP)在各种酶类代谢中起调控和促进作用，5种植物叶片可溶性蛋白含量随化感物质浓度的增高呈先上升后下降的趋势(图7).植物可溶性蛋白在0～20 mg·L-1范围内随着化感物质浓度的增高而不断累积，三色堇、鸢尾、大吴风草、白车轴草、麦冬分别为CK0.5的671.6%、440.4%、339.5%、222.9%和62.6%.而当浓度超过20 mg·L-1时，植物叶片萎蔫严重，蛋白质累积量小于分解量，含量开始下降.

2.9 化感物质对5种植物叶片脯氨酸含量的影响

逆境条件下，抗性越强的植物脯氨酸含量变化幅度越大(图8).5种植物的脯氨酸含量呈上升趋势，大吴风草和三色堇的脯氨酸含量在化感物质浓度超过10 mg·L-1时急剧上升，最高含量约为CK0.5的5.48倍和5.32倍.鸢尾、麦冬、白车轴草3种植物的最高脯氨酸含量约为CK0.5的1.78倍、2.74倍、3.78倍.可见，5种植物在化感作用中根据自身条件产生脯氨酸进行渗透调节，并发挥重要作用.

3 讨论

植物化感作用是自然界中普遍存在的一种生态机制[23]，影响受体植物在群落中的多度及竞争力[24,25]，因此，熟悉植物之间的生态习性，正确利用植物之间的化感作用，在水平方向上进行合理的园林植物配置(即平面上种植点的确定)，可以构建一个具有艺术美的生态园林.本试验中，白车轴草、大吴风草、三色堇、麦冬和鸢尾是南方园林绿化中常用的草本观赏植物.通过检测5种植物化感作用后的种子萌发率、萌发指数和根长的变化，以及检测生理指标(光合色素、电导率、MDA、POD、SOD、CAT、脯氨酸和可溶性蛋白)的变化，在种子萌发和幼苗生长方面全面研究喜树碱与10-羟基喜树碱对这5种植物的化感作用，注重植物在水平方向上近期效果与远期效果的结合，可使得植物的生态效益最大化.

本研究显分析上述各项检测指标，发现喜树碱与10-羟基喜树碱对5种植物的作用主要表现为对幼苗生长和种子萌发过程中各项指标产生或多或少的影响，从而表现出化感作用，且不同植物受到的影响程度不同.

化感物质在一定程度上抑制了5种草本观赏植物幼苗的生长，但是化感抑制强度不同，说明不同受体植物幼苗的生长对化感物质有着不同的敏感性，这与大多数的研究相一致[26,27].这可能是因为化感物质具有专一性和选择性，也可能与受体植物物种进化有关，确切原因需要进一步研究[28].另一方面，化感物质对5种草本观赏植物幼苗生长的化感效应表现为“剂量效应”，这可能和试验选择的作用浓度范围有关.

不同植物的不同发育时期对化感作用的敏感性不同[29].本研究结果表明，5种植物种子发芽阶段受喜树碱与10-羟基喜树碱的影响较明显，幼苗生长阶段的影响主要表现为叶片相对电导率呈不同程度的上升、叶绿素含量下降、脯氨酸和可溶性蛋白先升后降.正常情况下，植物体内活性氧的产生与清除是维持动态平衡的[30]，但本研究中化感物质作用后打破了这一平衡，与CK0.5相比，5种植物内部SOD、POD、CAT活性均先升后降，超出受体植物耐受范围后，膜脂过氧化终产物MDA含量增加，植物代谢紊乱，与Zhao et al[31,32]的研究结果基本一致.表明喜树碱类化感物质可以影响植物的多种指标.本试验中，化感作用后，植物种子萌发减少，幼苗细胞膜受到损害，Pro调节受到影响，植物的抗氧化酶活性发生变化，最终可使得植物在化感作用下生长缓慢甚至死亡，这可能是化感物质在生长和生理生化指标方面的作用机制之一，而对于植物光合荧光指标的影响，还需后续试验进一步研究.因而，在园林绿化中，应充分考虑植物间的化感作用，注重植物种类的选择以及配置方式、栽植密度等因素，减少植物间的相互影响，从而实现园林景观的生态美.

综上所述，喜树碱类物质对白车轴草、大吴风草、三色堇、麦冬和鸢尾5种受体植物表现出不同程度的化感抑制作用.但由于本试验在室内进行，避免了自然条件下各种因素的干扰，虽然结果能较好地反映化感作用强弱，但在自然条件下，化感作用是极为复杂的，除了要受自然环境因子的影响外，植株间竞争效应也会对化感作用的表现产生重要影响[33].因此，化感作用特点和自然条件对其他植物的影响是否和本研究所得结果一致，还需进一步研究.