中华鳖疥疮病原菌的分离鉴定及病理组织观察

邓时铭, 刘 丽, 褚武英, 李跃辉, 王江伟, 陈圆华

(1.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153；2.长沙学院生物工程与环境科学学院，湖南 长沙 410003；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

中华鳖(Peodiscussinensis)蛋白质含量高，营养丰富、全面，又可入药，是老百姓喜爱的水产品食物，也是我国重要的水产养殖经济动物[1].但随着中华鳖养殖业的发展，各类疾病频繁发生，如红脖子病、穿孔病、疥疮病、腐皮病等，给养殖户造成了重大经济损失，也给我国中华鳖养殖业的持续健康发展带来了巨大阻力.中华鳖疥疮病(病变后期又叫穿孔病[2])病原种类较多，有嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、点状产气单胞菌和普通变形杆菌等，存在单独感染、混合感染或继发感染，发病率可达到10%～50%，死亡率可达30%～40%[3-6].2018年6—10月，湖南汉寿某养殖场饲养的幼鳖出现疥疮病理特征，其运动迟缓，不摄食，背甲和腹甲部出现黄豆大小的白点并逐步扩大，白点内容物呈豆腐渣样，肠道无食物，肝脏有白点，呈花肝状，死亡率达100%.在排除寄生虫和病毒感染后，本试验对临死幼鳖疥疮病原菌进行分离，并采用人工感染回归试验验证病原菌致病性，通过16S rDNA基因和生理生化指标确定病原菌种类，通过病理组织切片观察机体的病理变化,并通过体外药物敏感性试验筛选防控药物，以期为中华鳖疥疮病的诊断与防控提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

发病幼鳖来源于湖南省汉寿县，单只质量约为100 g；健康幼鳖来源于湖南省水产原种场，单只质量约为120 g，体质健壮，外表无损伤.

1.2 病原菌的分离与纯化

无菌条件下，取体表病灶、肝脏、肠道内容物划线接种于营养琼脂平板上，28 ℃恒温培养24 h，再挑取单个优势菌落28 ℃纯化培养18～24 h，4 ℃保存备用.

1.3 分离菌形态鉴定

将分离菌分别接种于琼脂平板上，28 ℃恒温培养18～24 h，挑取单个菌落进行革兰氏染色和生理生化试验，结合《常见细菌系统鉴定手册》[7]、《Bergey′s manual of determinative bacteriology》[8]、《药理实验方法学》[9]和VITEK2-compact鉴定系统进行鉴定.

1.4 分离菌16S rDNA序列分析

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明方法提取分离菌株总DNA，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)为引物进行PCR扩增，釆用DNA纯化回收试剂盒纯化回收16S rDNA产物，然后由铂尚生物技术(上海)有限公司测序.将所得16S rDNA序列在NCBI的GenBank/Blast中进行同源性比对分析；通过ClustalW、DNAstar和Mega 4等软件，采用邻接法(neighbour-joining method)构建系统发育树.

1.5 人工感染试验

试验在室内进行.将健康幼鳖置于盛有自来水的小塑料桶中(自来水连续充气，水温保持28～30 ℃)，暂养7 d后开展人工感染试验，分设试验组6组和对照组1组，每组10只.将分离菌Lb18-01和Lb18-02在28 ℃恒温培养16～18 h后，用无菌生理盐水冲洗，分别配制成1.0×108、5.0×108、1.0×109cfu·mL-1细菌悬浊液，共6个浓度组.从幼鳖后肢窝注射0.1 mL菌液，对照组注射等量生理盐水.试验期间适量投喂，连续观察15 d，记录幼鳖发病情况，对濒死病鳖进行解剖及病原菌分离与鉴定.

1.6 致病菌的药物敏感性试验

采用纸片法进行药物敏感性试验[7]，每种药敏片(直径6 mm)重复5次.按照中华人民共和国卫生部制定的纸片法抗菌药物敏感试验标准(WS/T125)判断试验结果.供试药物和含药量见表1.

表1 药敏片种类

1.7 内脏病理组织观察

无菌条件下，取健康中华鳖和患病中华鳖的肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织制作常规病理切片，Olympus光学显微镜下拍照、观察，比较分析患病中华鳖组织结构的病理变化.

2 结果与分析

2.1 分离菌的形态特征

从患病中华鳖的体表病灶、肠道分离获得优势纯化菌1株，命名为Lb18-01；从肝脏分离获得优势纯化菌1株，命名为Lb18-02.将2株菌分别接种于普通营养培养基上，28 ℃培养24 h，分离菌Lb18-01在培养基上呈扩散生长，布满培养基表面，似云雾状，有腐败味；分离菌Lb18-02在培养基上形成圆形或椭圆形、淡黄色、半透明的菌落，表面湿润、光滑，无腐败味.分离菌Lb18-01革兰氏染色呈阴性，紫红色，杆状或丝状，长短不一(图1A)；分离菌Lb18-02革兰氏染色也呈阴性，紫红色，短杆状，两端钝圆(图1B).

2.2 分离菌的生理生化特性

试验表明，分离菌Lb18-01能分解葡萄糖、麦芽糖，有迁徙运动；分离菌Lb18-02不发酵鼠李糖、麦芽糖，接触酶阳性，无运动性(表2).结合文献[7-9]以及VITEK2-compact全自动细菌鉴定系统分析结果，初步认为分离菌Lb18-01为普通变形杆菌，分离菌Lb18-02为脑膜脓毒性黄杆菌.

表2 分离菌的生理生化特性1)

2.3 16S rDNA基因系统发育分析

按照试剂盒方法提取分离菌Lb18-01和Lb18-02的基因组总DNA，纯化回收后测得序列长度为1 416和1 387 bp，其GenBank登录号为MN685224和MN685235.通过NCBI中Blast在线比对分析，2株菌16S rDNA序列与GenBank库中的序列均有较高的相似性(98%～100%).系统发育树(图2～3)显示，分离菌Lb18-01的16S rDNA基因与Proteusvulgaris聚为一簇，分离菌Lb18-02的16S rDNA基因与Chryseobacteriummeningosepticum聚为一簇.由此进一步确定分离菌Lb18-01和Lb18-02分别为普通变形杆菌(Proteusvulgaris)和脑膜脓毒性黄杆菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

2.4 分离菌的人工感染试验结果

健康中华鳖注射分离菌Lb18-01和Lb18-02菌液后，第2天开始行动呆滞，食欲下降，并陆续出现死亡，死亡率随菌液浓度的增大而增加.第15天，1.0×109cfu·mL-1Lb18-01试验组死亡率达到70%，濒死中华鳖背、腹部先出现红斑点，后变白并逐渐脓性溃变；1.0×109cfu·mL-1Lb18-02试验组死亡率达到100%(表3)，病死中华鳖背、腹部无红斑点.经过解剖可见，Lb18-01和Lb18-02试验组中华鳖的肝脏和胆囊微肿大，肠道红肿，无食物，与自然发病症状相同；对照组未出现异常症状.这表明分离菌Lb18-01和Lb18-02均有较强的致病性.取人工诱发感染的中华鳖，再次进行病原菌分离，获得了与Lb18-01和Lb18-02形态、生理生化特性一致的菌株，表明分离菌Lb18-01和Lb18-02为中华鳖疥疮的病原菌.

表3 健康幼鳖注射不同浓度菌液后的死亡率

2.5 分离菌的药物敏感性

试验结果显示，青霉素、氨苄西林、四环素等20种抗生素药敏片(表1)周围均无抑菌圈产生，说明这20种抗生素药物对分离菌Lb18-01和Lb18-02无任何抑制或杀灭作用.

2.6 病理组织观察

中华鳖患病后，其肝、脾、肾和肠道组织呈现不同的病理特征.动脉管壁增粗，血管周围炎症细胞增多(图4A箭头1)；静脉血管破裂(图4A箭头2)，窦状隙扩张，淤积大量红细胞(图4B箭头1)；肝细胞界限模糊(图4B箭头2)，可见大量含铁血黄素沉着(图4B箭头3).脾脏被膜增厚，被膜血管扩张，内有大量红细胞和淋巴细胞(图4D)；红髓区扩大，可见大量红细胞、炎症细胞和含铁血黄素沉着(图4E箭头1、2、3)；大量淋巴细胞和红细胞结构异常，严重者破裂、解体，白髓区相对缩小，淋巴细胞数目明显减少，毛细血管扩张，淤积红细胞(图4E箭头4).

肾脏外侧区和内侧区均渗入大量炎症细胞，内侧区较外侧区病变严重；肾小管上皮细胞及胞核肿大，发生颗粒变性，细胞游离面微绒毛不明显，管腔变小或消失，肾小管间界限消失，成为合包体(图4G箭头2)；肾小球内毛细血管扩张，淤积大量血细胞(图4G箭头1)，部分肾小球出现坏死、解体(图4H).肠道黏膜层上皮细胞排列紊乱(图4J箭头1)、密集，杯状细胞颜色变深，有大量炎症细胞浸润(图4J箭头3)；固有层毛细血管扩张，淤滞大量红细胞，黏膜肌层淋巴细胞骤增(图4J箭头2)；黏膜下层和肌肉层血管肿胀，大量血细胞淤积其中(图4K).

3 讨论

本试验结果表明，分离菌Lb18-01和Lb18-02均为中华鳖疥疮病原菌，其致死率达70%以上.结合形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因系统发育分析，将分离菌Lb18-01和Lb18-02确定为普通变形杆菌(Proteusvulgaris)和脑膜脓毒性黄杆菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

普通变形杆菌和脑膜脓毒性黄杆菌广泛分布于自然界，是人和水产动物的条件致病菌[10-14]，也是人、畜、鱼共患重要病原[11,15].普通变形杆菌可引起伤口感染而出现疥疮[15]，也可造成中华鳖穿孔病和白板病[3]；脑膜脓毒性黄杆菌可引起疾病暴发，致死率高，水生动物中仅见牛蛙的相关报道[16].普通变形杆菌与脑膜脓毒性黄杆菌感染导致中华鳖疥疮病暴发，致死率达100%，在我国尚属首次发现.

据报道，中华鳖疥疮病传染性强，流行时间长，发病率高，死亡率达20%以上，随着病程的发展，疥疮溃疡恶化形成穿孔病[5,17].本次自然发病中华鳖自然发病病程为6～10个月，病程长，疥疮病理特征明显，患病前期仅呈现零星死亡，之后随着病程延长，中华鳖死亡率显著上升，可达100%，但未见穿孔现象.因此推断中华鳖先是感染普通变形杆菌致使疥疮病发生，后随着病情加重及机体抵抗力下降，继而感染脑膜脓毒性黄杆菌，内脏器官呈现不同程度的炎症、出血和淤血症状，进而引起多器官功能障碍[18-19]，死亡率显著上升.此外，可能由于水产养殖者乱用药物治疗中华鳖疥疮，导致病原菌对20种抗生素药物均产生了抗药性.目前，随着我国水产养殖规模的增大，病害发生愈加频繁，致病菌种类也愈加繁多，病理特征愈加复杂，在水产动物疾病诊断过程中，技术人员不宜单凭表面的病理特征来判断疾病种类和开处药方，还应辅以病原菌药物敏感性试验，保证科学、合理地选用和使用药物，延缓病原菌耐药性的产生.