互花米草SaNAC36转录因子克隆及表达分析

王涛涛, 杨 勇, 魏 唯, 曾维科, 郭亚楠, 林辰涛, 马留银

(1.福建农林大学林学院；2.基础林学与蛋白质组学研究中心；3.生命科学学院，福建 福州 350002)

互花米草(Spartinaalterniflora)是禾本科(Poaceae)、米草属(Spartina)多年生草本植物，具有较强的耐盐和繁殖能力，广泛分布于我国多个省份的沿海流域.同时，作为典型的盐生植物，互花米草在近年来受到科研人员的广泛研究，尽管缺少参考基因组，研究人员利用转录组测序手段仍然挖掘出许多盐胁迫调控相关的互花米草基因[1]，并且通过转基因技术证明了互花米草基因可以作为水稻耐盐改良的基因资源[2,3].

NAC家族蛋白是植物特有的转录因子，不仅调控植物的生长发育[4,5]，而且参与植物对非生物胁迫应答的调控过程[6].拟南芥NAC家族蛋白AtNAC2, AtNAC3和ANAC019通过调控胁迫相关基因的表达促进自身抵抗多种非生物胁迫[7-9]，水稻NAC095和NAC066蛋白在促进其耐寒和干旱胁迫中同样具有重要的作用[10,11].NAC家族蛋白在N端含有1个保守的结构域，该结构域又被分为5个亚结构域(A-E)，NAC蛋白C端的结构多种多样，从而发挥不同的转录激活功能[12].

AtNAC036作为拟南芥NAC家族成员之一，通过负向调控细胞的大小调控花茎器官的发育，在拟南芥中过表达AtNAC036基因导致植株长势矮小[13]，表明AtNAC036是拟南芥生长的抑制子.为了探究互花米草NAC36转录因子的功能，本研究从互花米草三代全长转录组测序数据中获得了拟南芥AtNAC036的同源基因SaNAC36，并对其蛋白结构域以及物种同源性进行了分析.为了分析基因和蛋白的表达特征，本研究利用qRT-PCR手段对SaNAC36在不同互花米草组织以及胁迫处理下的表达水平进行了检测，同时在烟草(Nicotianatabacum)和酵母(Saccharomyce)中对SaNAC36蛋白的亚细胞定位和转录激活活性进行了验证，并将SaNAC36基因过表达至拟南芥中以达到对SaNAC36转录因子功能的初步探究.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的互花米草种子和植株采自江苏省赣榆市(E119°16′，N34°46′)，首先将互花米草种子置于湿润的滤纸上萌发，1周后将萌发的幼苗转入1/2 Hoagland(pH 8.0)营养液中避光培养3～4周，生长条件设定为16 h光照(26 ℃)，8 h黑暗(16 ℃)，期间每隔3 d更换1次营养液.进行盐和ABA胁迫处理时，分别将互花米草幼苗培养在含有800 mmol·L-1NaCl和100 μmol·L-1ABA的营养液中；进行干旱胁迫处理时，将互花米草幼苗平铺于干燥的滤纸上.所有处理均在第0、1、8和24 h时间点进行取样，并将样本用锡箔纸包裹且立即冻于液氮中，-80 ℃保存备用.

1.2 生物信息学分析

通过与互花米草全长转录组数据库(http://plantpolya.org/SAPacBio/)进行比对获得拟南芥AtNAC36同源基因序列，进一步通过ORF预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)获得SaNAC36基因编码的氨基酸序列；在ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)上对蛋白的氨基酸数量、分子量以及等电点进行预测；利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得SaNAC36蛋白在其它植物中的同源序列，并使用DNAman软件进行蛋白序列比对并利用MEGA7软件绘制物种之间的同源进化树.

1.3 cDNA合成

用试剂盒(美基生物, 货号R4151-02)提取互花米草幼苗和不同组织的总RNA，具体操作参照说明书进行，对RNA进行定性定量检测确保其质量满足后续试验.取1 μg总RNA，然后利用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix反转录试剂盒(莫纳生物，货号RN05004M)合成第一链cDNA，在每个反转录体系中加入1 μL的DNase I用于去除RNA中残留的DNA，反应程序为：37 ℃，2 min；55 ℃，15 min；85 ℃，10 s，将cDNA浓度稀释至5 ng·μL-1后低温存储备用.

1.4 RT-PCR和qRT-PCR试验

RT-PCR和qRT-PCR试验所需引物序列如表1所示，以合成的cDNA作为模板，使用高保真PCR酶进行RT-PCR扩增.25 μL反应体系包含：5 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)、0.5 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA、0.5 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase(TaKaRa公司，货号R050Q)和8 μL RNAse-free水.反应程序：98 ℃，1 min；98 ℃，10 s，60 ℃，15 s，68 ℃，1 kb·min-1；68 ℃，7 min，扩增30个循环.

每个qRT-PCR反应体系包含10 μL SYBRGreen Master Mix(莫纳生物，RN04002M)、1 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA模板和7 μL RNAse-free水.反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，10 s，72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，扩增40个循环.引物GC含量保证在40%～60%且TM值在55～65 ℃之间.样本之间的表达量差异使用t-test进行计算，P值小于0.05定义为样本之间具有显著性差异.

1.5 烟草瞬时表达

利用特异性引物(表1)从互花米草cDNA中扩增出SaNAC36基因全长CDS序列，将纯化后的PCR产物连接到植物表达载体pCambia3301上GFP标签的N端，并随后将载体借助农杆菌AGL0转入烟草叶片中.烟草瞬时转化试验步骤主要包括：将200 μL阳性农杆菌菌液接入50 mL含有10 mmol·L-1MES、20 μmol·L-1乙酰丁香酮、50 mg·L-1卡那霉素以及50 mg·L-1利福平的LB液体培养基中过夜培养.第2天，把菌液低速(4 000 r·min-1)离心15 min后用重悬液(10 mmol·L-1MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-1MgCl2)混匀，并调D600 nm值至1.0～1.5之间.待重悬的菌液于室温放置2 h后用无菌注射器注射入新鲜的烟草叶片中，同时对注射位置进行标记，将浸染后的烟草避光培养过夜，第2天取出放置于温室继续生长2 d.进行显微观察时，提前取小块注射位置的烟草叶片于1 mg·L-1的DAPI染液中浸泡30 min，在倒置显微镜(Zeiss Axio Observer.A1)下分别观察SaNAC36以及对照蛋白在明场(bright field)、GFP和DAPI通道下的表达情况.

表1 本研究所需的引物序列1)

1.6 转录自激活试验

将SaNAC36基因全长CDS序列构建到酵母表达载体pGBKT7上SmaⅠ位点处，酵母菌感受态的制备和转化步骤参考酵母双杂手册(https://www.takarabio.com/).把含有VP16基因的pGBKT7载体和空载体分别作为正、负对照，将目的载体和正、负对照载体同时转入Y2HGold酵母菌中，并分别培养在缺少色氨酸(-Trp)的SD培养基上，30 ℃生长3 d后，从板上挑取单克隆摇菌，分别稀释10倍和50倍后重新培养在正常和添加40 μg·mL-1X-α-gal的SD缺陷培养基上.

1.7 在拟南芥中过表达SaNAC36基因

采用农杆菌介导的花絮浸染法将先前构建好的植物表达载体pCambia3301转化到rdr6-11背景的模式植物拟南芥中，详细的转化方案参考之前的研究[14].使用Basta(1∶1 000)对T1代转基因苗进行筛选，并对存活的幼苗做进一步鉴定.将转基因阳性苗继续播种至T3代，纯合的株系用于后续的表型观察与分析.

2 结果与分析

2.1 互花米草SaNAC36基因的序列分析

以互花米草三代全长转录组数据库为参考，通过比对获得与拟南芥AtNAC036同源的互花米草基因SaNAC36(Cluster28982-001).对SaNAC36基因的全长转录本进行ORF预测，其全长CDS为942 bp，编码313个氨基酸(图1).蛋白预测结果显示SaNAC36蛋白分子量约为35.2 ku，等电点为6.72.对SaNAC36基因全长CDS进行RT-PCR扩增进一步证明对SaNAC36转录本ORF的预测是正确的(图2).

2.2 互花米草SaNAC36蛋白序列与进化分析

利用互花米草SaNAC36蛋白序列在NCBI比对获得了水稻、玉米、高粱等物种的同源蛋白序列.比较互花米草、玉米、高粱、水稻和拟南芥的NAC36蛋白序列，发现它们在N端都含有保守的NAC结构域(A-E)(图3).进一步将互花米草与其它13种植物的NAC36蛋白构建系统进化树，发现互花米草与拟南芥NAC36蛋白同源性较高(图4).

2.3 互花米草SaNAC36基因的表达分析

为了探究SaNAC36因子与互花米草生长发育及胁迫应答之间的关系，本研究通过qRT-PCR对SaNAC36基因的表达量进行了分析.首先通过检测SaNAC36在互花米草不同组织中的表达量，结果表明，SaNAC36在叶片中表达量最高，相反在茎秆部分的表达量却较低(图5A).随后分别检测SaNAC36基因在盐、ABA以及干旱处理下互花米草幼苗根部中的表达变化，在3种胁迫条件下，SaNAC36基因的表达量均趋于下调，在NaCl处理8 h和ABA处理1 h时，SaNAC36表达量降至最低，而在干旱处理8 h时，SaNAC36表达量虽有些许回升的趋势，但表达量总体随着处理时间的增加而降低(图5B-D).这些结果表明，SaNAC36基因不仅具有组织表达差异性，同时也受到非生物胁迫的调控.

2.4 SaNAC36蛋白的亚细胞定位与转录自激活分析

转录因子通常在细胞核内发挥功能，为了验证互花米草SaNAC36蛋白是否具有转录因子功能，本研究首先在烟草叶片中检测SaNAC36蛋白的亚细胞定位情况.借助农杆菌将带有SaNAC36基因的表达载体瞬时转入烟草叶片中，然后通过对烟草叶片所表达荧光及细胞核显色位置的观察清楚地发现SaNAC36蛋白在烟草叶片表皮细胞的细胞核中表达(图6A).在酵母自激活试验中，转入pGBKT7-SaNAC36载体的酵母菌与转入正对照pGBKT7-VP16的结果相同，不仅可以生长在缺少Trp的SD培养基上，而且在含有X-α-gal的缺陷培养基上菌斑呈蓝色，然而转入pGBKT7的负对照菌斑却没有变蓝(图6B).这些结果共同表明SaNAC36蛋白具有转录激活活性，可能发挥转录因子功能.

2.5 在拟南芥中过表达SaNAC36基因产生植株矮小表型

为了进一步验证SaNAC36转录因子的功能，本研究将SaNAC36基因过表达至模式植物拟南芥中.通过Basta抗性筛选以及RT-PCR鉴定后得到表达成功的转基因株系8和9(图7A).对转基因株系的qRT-PCR试验证明，SaNAC36在过表达植株里的表达量显著高于对照组植株(图7B).对T3代转基因株系表型的观察发现，株系9拟南芥的长势明显弱于对照植株(图7C)，包括植株高度和果荚长度在内的一些生长受到显著抑制(图7D)，说明SaNAC36转录因子可能参与调控植物的生长发育.

3 讨论

NAC家族转录因子是植物特有且重要的调控因子，研究互花米草NAC蛋白功能对探索NAC转录因子与互花米草生长发育之间的关系具有重要意义.本研究在互花米草全长转录组中鉴定出NAC家族转录因子SaNAC36，并从序列比对、同源进化树、亚细胞定位、转录激活活性、基因表达以及转基因植株表型等方面对其进行分析.序列比对和系统进化树结果表明，互花米草与水稻、高粱、玉米以及拟南芥NAC36蛋白序列相似度很高，且在N端都含有保守的NAC结构域[12]，说明NAC36蛋白在植物中具有高度的同源性.亚细胞定位和转录自激活试验进一步证明了SaNAC36蛋白具有转录激活活性，更加表明SaNAC36具有发挥植物NAC36转录因子功能的基础.

基因差异表达是真核生物主要的调控方式，分析基因差异表达不仅可以研究基因在植物不同组织发育中的功能，同时也有助于探究基因在胁迫应答时的调控作用[16].本研究表明，SaNAC36基因在互花米草叶片中表达量较高，说明SaNAC36可能参与互花米草叶片生长发育的调控.与正向调控往往相反，参与负向调控的基因往往对植物的生长发育起抑制作用，当植物响应外界胁迫时，这类基因更倾向于降低自身的表达量[17,18]，研究表明，在高盐、ABA和干旱胁迫下，SaNAC36基因的表达均呈下调的趋势，说明SaNAC36因子在互花米草耐胁迫过程中可能主要起到负向调控的作用.

系统进化树分析表明，SaNAC36与拟南芥AtNAC036蛋白同源性最高，SaNAC36可能具有与AtNAC036相似的功能，因此本研究选择将SaNAC36基因克隆到拟南芥中以检测其是否能产生与AtNAC36转基因植株类似的表型[13].通过观察发现，过表达SaNAC36基因的拟南芥植株相比对照组植株更加矮小，包括植株高度和果荚长度在内的一些生长特征均受到抑制，说明互花米草SaNAC36因子同样具有负向调控细胞大小的功能.作为互花米草NAC家族成员之一，SaNAC36转录因子不仅具有保守的结构域，同时作为核定位的转录因子，具有与拟南芥AtNAC36蛋白相似的功能，不仅参与互花米草组织的生长发育，同时也参与互花米草响应非生物胁迫的负调控过程中.