高迁移率族蛋白1在钬激光致输尿管狭窄患者中的作用及甘草酸苷的体外抑制研究

陈柯宇 王 亮

(西南医科大学附属医院泌尿外科，泸州 646000)

钬激光因具有精确切割、方向性好、止血、碎石效率高等优点而广泛应用于泌尿系统疾病，包括输尿管碎石、尿道狭窄切开、肿瘤切除等。但是近年研究发现，钬激光碎石术后可发生输尿管黏连、狭窄甚至闭锁，导致肾功能受损，发生率高达5.3%[1]。钬激光致纤维化的机制尚不清楚，相应的治疗药物仍然缺乏。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)是一种广泛存在于哺乳动物细胞核内的DNA结合蛋白，可由坏死细胞被动释放，也可由活化的炎症细胞主动分泌[2,3]。进入细胞外间质的HMGB1在早期炎症与晚期纤维化中发挥重要作用，阻断HMGB1可以抑制纤维瘢痕的形成[4,5]。甘草酸苷是甘草根部提取的活性成分，也是HMGB1的特异性抑制剂，在一系列纤维化疾病中发挥治疗效应，包括特发性肺纤维化、肾间质纤维化等[6-8]。综上，本文旨在探讨HMGB1在钬激光致输尿管狭窄患者中的作用及甘草酸苷的体外抑制效应。

1 资料与方法

1.1资料 选取2016年3月至2019年1月我院收治的28例钬激光致输尿管狭窄患者作为研究对象。输尿管狭窄均为输尿管结石后行钬激光碎石术导致，而且均经泌尿系造影、三维CT、输尿管镜检查确诊。其中，男性19例，女性9例；年龄23～54岁，平均年龄38岁；17例为腰痛入院，11例为术后随访发现；输尿管上段狭窄8例，中段狭窄7例，下段狭窄13例。所有患者均在腹腔镜下行输尿管狭窄段切除，其中6例下段狭窄患者，因狭窄处距膀胱壁≤2 cm，需行膀胱输尿管再植术，其他患者均行端端吻合术[9]。收集术中切除的输尿管狭窄段组织，液氮速冻后保存。所有患者均签署了知情同意书，本研究已获我院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1输尿管组织中HMGB1与促炎、促纤维化因子水平的检测 使用荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测输尿管狭窄段组织中各因子mRNA水平，包括HMGB1、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)。具体步骤为：取术中切除的输尿管狭窄段组织，剪碎后，在加有液氮的研钵中研磨成粉，使用Trizol Reagent试剂盒(美国Invitrogen公司)提取组织中的总mRNA，逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)转录为cDNA，然后使用荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)扩增目的基因。各基因的引物序列见表1，合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2.2细胞培养和分组 人输尿管上皮SV-HUC-1细胞购于美国典型培养物保藏中心，培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的F12K培养基，培养条件为37℃、5%CO2。根据钬激光照射的能量值将SV-HUC-1细胞随机分为5组，即0 mJ、200 mJ、400 mJ、600 mJ、800 mJ，激光照射48 h后，检测各组细胞HMGB1的表达量。根据实验结果，选择800 mJ钬激光照射48 h 作为随后实验的条件，将SV-HUC-1细胞随机分为3组，即对照组、钬激光组、钬激光+甘草酸苷组。对照组不给予钬激光照射；钬激光组给予800 mJ 钬激光照射；钬激光+甘草酸苷组给予800 mJ 钬激光照射，并于照射后立即加入终浓度为10 μmol/L的甘草酸苷处理。

1.2.3Western blot检测HMGB表达 收集各组细胞，加入RIPA裂解液充分裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清进行BCA蛋白定量。取40 μg总蛋白进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳，将目的蛋白电转移至PVDF膜，5%的牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入一抗稀释液4℃过夜孵育，各一抗稀释度：HMGB1为1∶1 000、TLR4为1∶500、p-NFκB为1∶500、GAPDH为1∶2 000。洗涤后，加入二抗室温孵育1 h，洗涤后显色，凝胶成像仪下拍照。

1.2.4免疫荧光染色 收集各组细胞，加入多聚甲醛固定30 min，洗涤后加入5%的牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗稀释液4℃过夜孵育，各一抗稀释度均为1∶100。洗涤后，加入含有FITC或Cy3荧光标签的二抗37℃孵育30 min，洗涤后DAPI染色，洗涤后荧光显微镜下拍照。

1.2.5酶联免疫吸附试验 留取细胞培养上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白的含量。

2 结果

2.1HMGB1表达与促炎、促纤维化因子水平的相关性 钬激光致输尿管狭窄患者的输尿管组织qRT-PCR检测结果显示：HMGB1 mRNA表达与IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA水平呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 HMGB1表达与促炎、促纤维化因子水平的相关性分析Fig.1 Correlation analysis between HMGB1 expression and proinflammatory,profibrotic factors

2.2不同能量的钬激光照射对HMGB1表达的影响 Western blot检测结果显示：随着钬激光照射能量的升高，HMGB1表达量逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 Western blot检测HMGB1在不同能量钬激光照射下的表达量Fig.2 Western blot was used to detect expression of HMGB1 irradiated by holmium laser with different energyNote:Compared with 0 mJ,*.P<0.05; compared with 200 mJ,#.P<0.05; compared with 400 mJ,△.P<0.05; compared with 600 mJ,&.P<0.05.

2.3各组细胞HMGB1及下游TLR4/NF-κB信号通路表达的比较 各组细胞免疫荧光检测结果显示：与对照组相比，钬激光组细胞HMGB1荧光强度明显增强；与钬激光组相比，钬激光+甘草酸苷组细胞HMGB1荧光强度明显减弱(图3)。

图3 免疫荧光染色检测各组细胞HMGB1的表达与分布Fig.3 Immunofluorescence staining was used to detect expression and distribution of HMGB1 in cells of each group

各组细胞Westren blot检测结果显示：与对照组相比，钬激光组细胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与钬激光组相比，钬激光+甘草酸苷组细胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

图4 Western blot检测各组细胞HMGB1及TLR4/NF-κB信号通路的表达Fig.4 Western blot was used to detect expression of HMGB1 and TLR4/NF-κB signaling pathway in cells of each groupNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with holmium laser group,#.P<0.05.

2.4各组细胞炎症及纤维化因子水平的比较 各组细胞上清ELISA检测结果显示：与对照组相比，钬激光组细胞上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与钬激光组相比，钬激光+甘草酸苷组细胞上清液中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 引物序列

2.5各组细胞上皮间质转化的比较 各组细胞免疫荧光检测，结果显示：与对照组相比，钬激光组细胞E-cadherin荧光强度明显减弱，Vimentin荧光强度明显增强；与钬激光组相比，钬激光+甘草酸苷组细胞E-cadherin荧光强度明显增强，Vimentin荧光强度明显减弱(图5)。

表2 ELISA检测各组细胞上清中相关因子的含量

图5 免疫荧光染色检测各组细胞E-cadherin(绿色)和Vimentin(红色)表达Fig.5 Immunofluorescence staining was used to detect expression of E-cadherin (green) and Vimentin (red) in cells of each group

3 讨论

钬激光在碎石的同时，其热效应也严重损伤正常的输尿管组织，引起炎症细胞浸润、促炎因子释放、上皮间质转化、促纤维化因子分泌等病理变化，最终导致纤维瘢痕的形成。术后早期运用卡托普利等药物可以抑制胶原蛋白的沉积，降低狭窄的发生率，可见早期药物干预的重要性[10]。但是，钬激光致纤维化的机制仍不清楚，是目前开发针对性药物的主要问题。

HMGB1在细胞核内参与DNA复制、转录与修复，而在感染、机械应力、热效应等刺激条件下可被动释放至细胞外，巨噬细胞、树突状细胞等炎症细胞也可迁移至损伤位点主动分泌HMGB1[11]。细胞外的HMGB1可与肺泡上皮细胞、肾上皮细胞等组织细胞及巨噬细胞等炎症细胞表面的TLR4受体结合，激活下游的NF-κB信号通路，促进炎症的级联放大效应，因此被认为是一种强有力的促炎因子[12,13]。近年，越来越多的研究发现HMGB1也与纤维化疾病密切相关，如肝纤维化、自发性肺纤维化、肾间质纤维化等[14]。此外，抗HMGB1抗体被认为在纤维化治疗中具有一定的应用前景[5]。钬激光致输尿管损伤的前期以炎症反应为主，晚期以纤维化进程为主，因此本研究推测HMGB1可能在此病理过程中发挥关键作用，并以此为切入点开展相关研究。

为了探讨HMGB1与促炎、促纤维化因子的相关性，本研究首先选取钬激光致输尿管狭窄患者作为研究对象，收集输尿管狭窄段切除术中获取的狭窄段组织，qRT-PCR检测HMGB1与各因子的mRNA水平，结果显示随着HMGB1 mRNA表达升高，促炎因子(IL-1β、TNF-α)及促纤维化因子(TGF-β1)mRNA水平也明显升高，两者呈正相关，表明HMGB1可能参与钬激光导致的炎症和纤维化过程。由于临床上获取正常输尿管组织存在较大困难，本文未对狭窄段和正常组织间HMGB1水平进行比较，因此上述结论仍需要更多的研究证据支持，未来可以通过构建相关动物模型以验证结论。

甘草酸苷是中药甘草中的活性成分，可通过阻断HMGB1发挥免疫调节、抗病毒等生物学效应[15]。本研究构建了钬激光照射输尿管上皮细胞的体外模型，结果表明HMGB1表达量具有照射剂量依赖效应，为了更有效地研究甘草酸苷治疗效应，本文后续实验选择800 mJ钬激光照射48 h作为条件。免疫荧光染色、Western blot实验结果表明，甘草酸苷可有效抑制HMGB1表达，进而阻断下游TLR4/NF-κB信号通路的激活，与其他研究报道相一致[16-18]。输尿管上皮细胞在钬激光照射下，炎症及纤维化因子可不断分泌，细胞外环境显著改变，使细胞无法维持正常的上皮表型，而逐渐向间质细胞转化。本文对细胞上清液中各因子含量及细胞表型分别进行了检测，结果显示甘草酸苷可改善炎症及纤维化因子分泌失衡的状态，维持上皮细胞表型(E-cadherin)表达，抑制间质细胞表型(Vimentin)表达，表明甘草酸酐可有效抑制钬激光导致的炎症、纤维化及上皮间质转化。该结论既进一步证实了HMGB1在钬激光致输尿管损伤中的病理作用，又为钬激光碎石术后早期应用甘草酸苷提供了一定的理论基础。

综上所述，在钬激光致输尿管狭窄患者的输尿管组织中，HMGB1表达与促炎及促纤维化因子水平呈正相关。在钬激光照射输尿管上皮细胞的体外模型中，甘草酸苷可抑制HMGB1及其下游TLR4/NF-κB信号通路的激活，下调炎症及纤维化因子的表达，抑制细胞发生上皮间质转化。