miR-33a-5p靶向SMAD7对血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外基质降解的影响①

朱彦彬 李 立 王贤芝 仲 伟 张富钊

(川北医学院附属医院血管外科,南充 637000)

心血管疾病是世界人口死亡的主要原因，主要包括冠状动脉疾病、中风、动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死和中风等[1]。研究表明血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖是动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展的重要因素[2]。在病理条件下，生长调节因子、细胞因子和血管活性物质的异常升高能够促进血管平滑肌细胞的增殖，并改变血管平滑肌细胞的基因表达[3]。其中，血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是最有效的诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的因子之一[4]。miRNA表达异常与心血管疾病密切相关，是靶向治疗心血管疾病的新路径。已有众多文献报道miR-33有助于调节高密度脂蛋白胆固醇的动态平衡，提示其或许能够成为心血管疾病和新陈代谢疾病的潜在靶标，但其对血管平滑肌细胞增殖、凋亡及细胞外基质降解的影响并不清楚[5]。SMAD7过表达能够促进细胞增殖，其在血管平滑肌细胞增殖中具有重要作用[6，7]。本文主要探究miR-33a-5p靶向SMAD7对血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外基质降解的影响，为心血管疾病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 DMEM培养基购自上海慧颖生物(货号：C11960500BT)，胎牛血清购自素尔生物(货号：16000-044)，miR-33a-5p mimic和SMAD7质粒购自上海生物工程，Trizol试剂(货号：kp800-101)购自宁波有成生物医药科技有限公司，BCA试剂盒(货号：ZY80815)购自上海泽叶生物科技有限公司，Dual Luciferase报告基因试剂盒(货号：GM-040502A)购自上海翊圣生物科技有限公司，CCK-8试剂盒(货号：CK0115-01)购自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.2细胞 血管平滑肌细胞购自中国上海科学院细胞库，于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2方法

1.2.1转染及PDGF-bb处理 根据Lipofectamine 2000说明书将miR-33a-5p mimic和SMAD7质粒分别或者联合转染至血管平滑肌细胞。PDGF-bb处理浓度为10～30 ng/ml，分别于24、48和72 h用CCK-8法测定增殖。

1.2.2RT-PCR 将细胞收集后用Trizol试剂提取总RNA，进行定量分析并调平后，用反转录试剂盒合成cDNA。以GAPDH为内参进行RT-PCR检测。GAPDH上游引物序列：5′-ATGGGGAAGGT-GAAGGTCG-3′，下游引物序列：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′；miR-33上游引物序列：5′-CCAGCTGGGGTGCATTGTAGT-3′，下游引物序列：5′-GGGAGCAGAATTAATACGACTCACTATAGC-3′；SMAD7上游引物序列：5′-CAACTGCAGACTGTCC-AGATG-3′，SMAD7下游引物序列:5′-CTGCTGCATAAACTCGTGGTC-3′。

1.2.3靶基因预测 运用基因预测软件：miRanda(http://www.microna.org/microrna/home.do)、Tar Base(http://diana.calab.ece.ntua.gr/tarbase)、TargetScan(http:// www.targetscan.org) 和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，预测miR-33a-5p的靶基因。

1.2.4双荧光素酶报告实验 以海肾荧光素酶的荧光值作为内参，按照Dual Luciferase报告基因试剂盒说明书进行。

1.2.5CCK-8检测细胞增殖能力 在96孔板中配制100 μl的细胞悬液，将培养板在37℃、5%CO2培养箱培养，分别以24、48和72 h为检测点，在450 nm处检测。每次检测前每孔加CCK-8溶液10 μl，继续孵育1 h，终止培养。

1.2.6Western blot 用RIPA裂解液提取各组血管平滑肌细胞总蛋白，并用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，然后经 SDS-PAGE分离蛋白后，用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜，并用脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，再加入一抗在4℃封闭过夜，然后加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴ECL曝光。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡 加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，离心弃上清，收集细胞，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。离心弃上清，加入 190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μl 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，采用流式细胞仪检测。

1.2.8划痕实验检测细胞迁移 将细胞消化铺满单层后用小号枪头垂直划痕，加入无血清培养基，在5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24 h后，显微镜下拍照，用 Image J 软件分析。

2 结果

2.1PDGF-bb处理对VSMCs细胞增殖和miR-33表达的影响 PDGF-bb对VSMCs的增殖具有时间依赖性和浓度依赖性，且在30 ng/ml和72 h差异具有统计学意义(P<0.01，图1A、B)。qRT-PCR检测发现PDGF-bb处理显著抑制miR-33在VSMCs细胞中的表达，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图1C、D)。

图1 PDGF-bb对VSMCs细胞增殖和miR-33a-5p表达的影响Fig.1 Effect of PDGF-bb on cell proliferation and miR-33a-5p expression in VSMCsNote:A.Effect of different treatment time of PDGF-bb on proliferation of VSMCs cells was detected by CCK-8;B.Effect of different concentrations of PDGF-bb on proliferation of VSMCs cells was detected by CCK-8;C.Effect of different treatment time of PDGF-bb on expression of miR-33a-5p in VSMCs cells was detected by qRT-PCR;D.Effect of different concentrations of PDGF-bb on expression of miR-33a-5p in VSMCs cells was detected by qRT-PCR.*.P<0.05，**.P<0.01 versus control group.

2.2miR-33a-5p直接靶向SMAD7 由基因预测软件筛选出SMDA7作为miR-33a-5p的靶基因，miR-33a-5p与SMAD7在3′UTR区存在结合位点(图2A)； 荧光素酶报告基因实验结果表明：miR-33a-5p与野生型SMAD7荧光素酶活性明显降低(P<0.01，图2B)，与突变型没有明显变化，说明miR-33a-5p直接靶向作用于SMAD7。

图2 miR-33a-5p靶向作用于SMAD7Fig.2 miR-33a-5p targets to SMAD7Note:A.Target genes of miR-33a-5p were screened by gene prediction software miRanda，TargetScan and Pubmed;B.Targeting relationship was detected by luciferase activity;**.P<0.01 versus control group.

2.3miR-33a-5p过表达对miR-33和SMAD7 mRNA表达的影响 qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞miR-33明显上调、SMAD7 mRNA表达明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3A)；SMAD7组VSMCs细胞miR-33明显下调、SMAD7 mRNA表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3A)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞miR-33表达比miR-33a-5p mimic组明显下调、比SMAD7组明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3A)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞SMAD7表达比miR-33a-5p mimic组明显上调、比SMAD7组明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3A)。

通过Western blot检测SMD7蛋白表达水平发现：与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞SMAD7蛋白表达明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3B)，SMAD7组VSMCs细胞SMAD7蛋白表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3B)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞SMAD7表达比miR-33a-5p mimic组明显上调、比SMAD7组明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图3B)。

图3 miR-33a-5p和SMD7表达水平Fig.3 miR-33a-5p and SMD7 expression levelsNote:A.Expression levels of miR-33a-5p and SMD7 mRNA were detected by qRT-PCR;B.Expression level of SMD7 protein was detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.4miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs细胞增殖 与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞增殖明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.01，图4A)，SMAD7组VSMCs细胞增殖明显增强，差异具有统计学意义(P<0.01，图4A)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞增殖比miR-33a-5p mimic组明显增强、比SMAD7组明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.01，图4A)。

与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞增殖标记蛋白PCNA和Ki67明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图4B)，SMAD7组VSMCs细胞增殖标记蛋白PCNA和Ki67明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图4B)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达比miR-33a-5p mimic组明显上调、比SMAD7组明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图4B)。

图4 各组细胞增殖情况Fig.4 Cell proliferation in each groupNote:A.Proliferation of each group was detected by CCK-8;B.Expression levels of PCNA and Ki67 were detected by Western blot;**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.5miR-33a-5p靶向SMAD7诱导VSMCs细胞凋亡 与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞凋亡明显增强，差异具有统计学意义(P<0.01，图5A)，SMAD7组VSMCs细胞凋亡明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.01，图5A)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞凋亡比miR-33a-5p mimic组明显减弱、比SMAD7组明显增强，差异具有统计学意义(P<0.01，图5A)。

与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图5B)，SMAD7组VSMCs细胞凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图5B)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9表达比miR-33a-5p mimic组明显下调、比SMAD7组明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图5B)。

图5 各组细胞凋亡情况Fig.5 Apoptosis of each groupNote:A.Apoptosis of each group was detected by flow cytometry;B.Expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blot;**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.6miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs细胞迁移 与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞伤口愈合率明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01，图6)，SMAD7组VSMCs细胞伤口愈合率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01，图6)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞伤口愈合率比miR-33a-5p mimic组明显升高、比SMAD7组明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01，图6)。

图6 划痕实验检测细胞迁移能力(×400)Fig.6 Migration ability of each group was tested by scratch test(×400)Note:**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.7miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs细胞外基质降解 与对照组相比，miR-33a-5p mimic组VSMCs细胞MMP-2和MMP-9明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图7)，SMAD7组VSMCs细胞MMP-2和MMP-9明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01，图7)；mimic+SMAD7 组VSMCs细胞MMP-2和MMP-9表达比miR-33a-5p mimic组明显上调，比SMAD7组明显下调，差异具有统计学意义(P<0.01，图7)。

图7 Western blot检测MMP-2和MMP-9的表达水平Fig.7 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotNote:**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

3 讨论

血管平滑肌细胞异常增殖已被证明能加速血管疾病的发展，了解血管平滑肌细胞异常增殖的分子机制对确定新的心血管疾病治疗靶点至关重要。PDGF-bb主要由血管内皮细胞和血小板在血管损伤部位释放，已有研究显示PDGF-bb能够通过调节转录因子和关键分子信号通路促进血管平滑肌细胞增殖和迁移[8]。PDGF-bb处理对血管平滑肌细胞中miRNA的表达具有不同的调控作用，即可使miR-15b、miR-541、miR-146b-5p等miRNA表达上调，也能抑制miR-599、miR-21、miR-145等miRNA的表达[9-11]。本研究结果表明：PDGF-bb处理能够增强血管平滑肌细胞细胞增殖，抑制miR-33的表达。大量研究表明，miRNA参与细胞发育、生长、分化、增殖和凋亡等多种细胞过程[12]。通过与靶基因的3′UTR结合来调节基因表达，并导致蛋白质翻译抑制，从而发挥作用[13]。本文通过研究发现：miR-33a-5p与SMAD7在3′UTR区存在结合位点，miR-33a-5p直接靶向作用于SMAD7，且miR-33a-5p过表达会抑制SMAD7的表达。

miRNA靶向调控在血管平滑肌细胞增殖中发挥重要作用，如miR-145通过靶向CD40对血管平滑肌细胞增殖有抑制作用[14]。本研究发现：miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞增殖，并下调增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达。miRNA靶向调控在血管平滑肌细胞凋亡中也具有重要作用，如Shen等[15]研究发现miR-29b靶向MMP-2促进平滑肌细胞凋亡。本研究流式和Western blot检测发现，miR-33a-5p靶向SMAD7促进PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞凋亡，上调凋亡标记蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。miRNA靶向调控在血管平滑肌细胞迁移中也具有重要作用，如miR-503通过靶向胰岛素受体抑制PDGF-bb诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移[16]。本研究通过划痕实验发现，miR-33a-5p靶向SMAD7能够降低PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞伤口愈合率，抑制血管平滑肌细胞迁移。

血管平滑肌细胞的增殖和迁移常伴有细胞外基质的降解与重构的快速转换，而MMPs是细胞外基质的降解与重构的关键酶。MMPs是一个依赖Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子的内肽酶家族，其在细胞外基质的降解和调节细胞与细胞黏连、细胞迁移和浸润、细胞增殖与凋亡、组织重塑等生理活动中发挥着重要作用[17]。MMP-2主要作用是降解细胞外基质的基底膜，Park等[18]研究发现MMP-2上调增加血管平滑肌细胞基质的降解，并促进血管平滑肌细胞的迁移；MMP-9主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡，Aesim等[19]报道MMP-9是调节平滑肌细胞增殖和迁移所必需的；Mason等[20]研究表明MMP-9过表达增加血管平滑肌细胞基质的降解，并增强血管平滑肌细胞迁移。因此，MMP-2和MMP-9的上调会促进平滑肌细胞外基质的降解，增强细胞的迁移。本研究发现，miR-33a-5p靶向SMAD7抑制血管平滑肌细胞MMP-2和MMP-9 的表达，说明miR-33a-5p能够靶向SMAD7抑制PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞外基质的降解。

综上所述，本研究初步证明PDGF-bb处理可增强血管平滑肌细胞细胞增殖，抑制miR-33表达。miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质的降解，并促进凋亡。miR-33a-5p有望成为新的心血管疾病治疗靶点，这为心血管疾病的预防和治疗奠定实验基础。