CXXC5对心房颤动大鼠心肌纤维化的影响及机制①

李小兵 王 军 吕 瑛 黄建成 李红英 李志杰 苏振宇

(河北医科大学第一医院心脏外科,石家庄 050031)

心房颤动是潜在的心脏疾病，是常见的持续性快速型心律失常，患病率和死亡率均较高，男性的发病率高于女性，且随着年龄的增长，心房颤动的患病率升高，随着人口老龄化，心房颤动对人类健康造成严重威胁，心肌纤维化在心房结构重构中具有重要作用，是心房颤动发生的重要原因之一[1,2]。TGF-β是组织修复和纤维化发生的主要因素，TGF-β1可诱发心肌纤维化，Smads家族蛋白是TGF-β信号传导通路中的关键传导分子，TGF-β1/Smad信号通路是其最重要的传导通路[3,4]。CXXC5具有信号转导、细胞能量代谢、细胞凋亡、血管生成等生物学功能，在多种疾病发病中的作用越来越受到重视，在恶性肿瘤中作为一种潜在的肿瘤抑制因子，参与皮肤损伤后皮肤纤维化的形成，但其在心肌纤维化中的作用尚不清楚[5,6]。本文对CXXC5在心房颤动心肌纤维化中的表达及作用机制进行研究，探讨其在心房颤动心肌纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 6～8周龄、雄性、清洁级、体质量210～220 g SD大鼠70只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.1.2主要试剂 ISO、苏木素、伊红(美国Sigma公司)，BCA试剂盒、β-actin抗体、Ⅰ型胶原单克隆抗体、CXXC5单克隆抗体、TGF-β1单克隆抗体、Smad7单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体等(美国BT公司)，Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7(上海生物工程技术有限公司引物设计与合成)，CXXC5过表达质粒腺病毒载体和阴性对照质粒腺病毒载体(天津赛尔生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及建立心房颤动模型 将40只大鼠分为对照组、空白对照组、阴性对照组和过表达CXXC5组，每组10只。空白对照组、阴性对照组和过表达CXXC5组大鼠建立心房颤动心肌纤维化模型：大鼠腹部皮下注射ISO(5 mg/kg，1次/d，共14 d)，对照组腹部皮下注射等量生理盐水；用药后采用生物信号采集处理系统(MedLab-U/4C501H)描记大鼠心电图，记录标准Ⅱ导联。对照组为标准Ⅱ导联心电图，建模大鼠出现标准Ⅱ导联心房颤动心电图(见图1)，表示心房颤动模型建立成功(标准Ⅱ导联心房颤动心电图：①P波消失、代之以大小不等，形态各异的小F波，小F波的频率350～600次/min；②心室率极其不规则，心室率100～160次/min；③QRS波群的形态正常，当心室率较快时，QRS波群可以增宽变形)。Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平测定 取100 g心肌组织在冰上匀浆器中剪碎，加入Trizol研磨混匀后提取心肌组织总RNA，采用荧光定量PCR(qPCR)测定各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原。

1.2.2处理 造模后第2天，过表达CXXC5组大鼠经尾静脉注射过表达CXXC5病毒5×109PFU，阴性对照组经尾静脉注射等量阴性对照病毒，对照组和空白对照组经尾静脉注射等量生理盐水。注射后第7天处死大鼠，取心脏组织备用。

1.2.3HE染色 将石蜡包埋心肌组织切成5 μm切片，烤片30 min，脱蜡水化，苏木素染色1 min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分化10 s，蒸馏水冲洗，氨水返蓝30 s，蒸馏水冲洗，伊红染色20 s，酒精脱水，二甲苯透明，封片后显微镜下观察染色情况。

1.2.4Masson染色 将石蜡标本切片烤片 30 min，脱蜡水化，蒸馏水冲洗，苏木精染色10 min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分化5 s，蒸馏水冲洗，Masson丽春红酸性复红液染色10 min，蒸馏水冲洗，磷钼酸溶液染色，甲苯胺蓝染色10 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察染色情况。

1.2.5胶原容积分数(CVF)测定 Masson染色后胶原纤维被染成紫蓝色，纤维素和心肌细胞被染成紫红色，应用IBAS Ⅱ图像软件分析系统，测定CVF，CVF=胶原面积/总面积。

图1 两组大鼠Ⅱ导联心电图Fig.1 Ⅱ lead ECG of rat in two groups

1.2.6大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平测定 取100 g心肌组织在冰上匀浆器中剪碎，加入Trizol研磨混匀后提取心肌组织总RNA，采用荧光定量PCR(qPCR)测定各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原(上游引物：5′-GATCTGTATCTGCCACAATG-3′，下游引物：5′-CAGAAAGCACAGCACTCGCC-3′)、CXXC5(上游引物：5′-GTGGACGGCTCGCGCAGTTG-3′，下游引物：5′-CACACGACCACTGACATTGC-3′)、TGF-β1(上游引物：5′-TGGCGTTAGCTTCGTAAGG-3′，5′-GTGTTGACCG-TTTGCAG-3′)、Smad7(上游引物：5′-AGGCTGTACTGTATCCAAGA-3′，下游引物：5′-GAATTAATGAA-GATAGGGTA-3′) mRNA水平，PCR反应条件为：95℃ 10 min；95℃ 20 s、62℃ 30 s、72℃ 15 s，共40个循环；72℃ 5 min。以U6(上游引物：5′-CTCGCTTGGCCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTGAGGAATTTGCGT-3′)为内参，大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.7心肌组织中 Ⅰ 型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平测定 将各组大鼠心肌组织放入EP管中、加入蛋白裂解液裂解，13 000 r/min离心15 min后取上清，采用BCA法测定心肌组织蛋白浓度，采用Western blot法测定大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平，经凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗( Ⅰ 型胶原单克隆抗体稀释比例1∶1 000、CXXC5单克隆抗体稀释比例1∶1 000、TGF-β1单克隆抗体稀释比例1∶1 000、Smad7单克隆抗体稀释比例1∶500)过夜孵育，以β-actin为内参照，加入HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶3 000)孵育1 h,ECL显影。目标蛋白的相对表达量=目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

2 结果

2.1各组大鼠心肌HE染色 HE染色显示心肌细胞被染成紫红色，心肌细胞核被染成紫蓝色。对照组大鼠心肌细胞横纹清晰、细胞排列整齐，细胞大小正常；空白对照组和阴性对照组大鼠心肌细胞显著增大、排列紊乱，间质增多，有明显成纤维细胞增生；过表达CXXC5组大鼠心肌细胞排列稍紊乱，间质稍增多，有少量成纤维细胞增生，见图2(图中箭头所示为成纤维细胞)。

2.2心房颤动心肌纤维化大鼠心肌Masson染色 Masson染色显示心肌间质胶原纤维呈紫蓝色，心肌细胞呈紫红色，细胞核呈黑色。对照组心肌细胞排列整齐、胶原纤维含量少，细胞大小正常；空白对照组和阴性对照组大鼠心肌细胞排列紊乱，间质胶原纤维增多，心肌纤维化严重；过表达CXXC5组心肌细胞排列稍紊乱，有少量胶原沉积。与对照组相比，其他三组大鼠CVF升高(P<0.05)，与空白对照组和阴性对照组相比，过表达CXXC5组大鼠CVF降低(P<0.05)，空白对照组和阴性对照组大鼠CVF差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表1(图中箭头所示为胶原沉积)。

2.3过表达CXXC5对心房颤动心肌纤维化大鼠心肌组织中 Ⅰ 型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平的影响 与对照组相比，其他3组大鼠心肌组织中CXXC5、Smad7 mRNA水平降低(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平升高(P<0.05)；与空白对照组和阴性对照组相比，过表达CXXC5组大鼠心肌组织中CXXC5、Smad7 mRNA水平升高(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平降低(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组大鼠心肌组织中CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图2 各组大鼠心肌组织HE染色(×200)Fig.2 HE staining of myocardial tissue in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

图3 各组大鼠心肌组织Masson染色(×200)Fig.3 Masson staining of myocardial tissues of rats in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

表1 各组大鼠CVF比较

图4 各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平Fig.4 Type Ⅰ collagen,CXXC5,TGF-β1 and Smad7 mRNA levels in each groups of rat myocardial tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with blank control group,#.P<0.05；compared with negative control group,△.P<0.05.

2.4过表达CXXC5对心房颤动心肌纤维化大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、 Smad7蛋白水平的影响 与对照组相比，其他3组大鼠心肌组织中CXXC5、Smad7蛋白水平升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平降低(P<0.05)；与空白对照组和阴性对照组相比，过表达CXXC5组大鼠心肌组织中CXXC5、Smad7蛋白水平降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平升高(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组大鼠心肌组织中CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图5。

表2 各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比较

图5 Western blot检测各组大鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白表达Fig.5 Western blot analysis of type I collagen，CXXC5,TGF-β1 and Smad7 proteins in each group of rat myocardial tissueNote:1,2.Control group；3,4.Blank control group；5,6.Negative control group；7,8.Over-expressed CXXC5 group.

3 讨论

心房颤动的发病机制比较复杂，目前认为心房颤动是心房重构、异常钙离子电流、自主神经系统改变共同作用的结果，其中心房重构是心房颤动的重要环节[7]；心房重构包括心房电重构和心房结构重构，心房电重构是由于缝隙连接蛋白功能及数量和心房肌离子通道的改变所引起，心房电重构可引起心房肌有效不应期缩短、不应期离散度增加、传递受损、触发活动增多、传导各向异性增加，有利于局部多子波和微折返的形成[8]；心房结构重构的显著特征为心房纤维化，正常心肌细胞被胶原纤维化包绕划分，从而破坏心肌细胞之间的传导连续性，引起传导异质性增加、传导速度减慢，为折返环的形成和单项传导阻滞提供了病理基础[9]。心房颤动还可导致心房扩大、心房收缩力下降，有利于心房颤动的维持发展。临床上抗心律失常药主要针对心房电重构，因此治疗效果有限；心房纤维化作为心房颤动最危险的因素，探讨其发病机制对阻断心房结构重构具有重要意义，可为心房颤动的预防和治疗提供新的思路。

TGF-β为一种多功能细胞因子，在纤维化发生中具有重要作用，是关键的促进纤维化因子，对沉积细胞外基质具有强烈的促进作用[10]；TGF-β1是TGF-β的亚型之一，可促进心肌细胞中Ⅰ型胶原纤维蛋白的合成和分泌，从而诱导心肌纤维化的发生[11]。Smads蛋白家族是TGF-β信号传导的介导子，TGF-β1发挥生物学作用的主要通路为TGF-β1/Smad信号通路，Smad7是该信号通路的抑制性蛋白，可以和Smad2和Smad3竞争性结合，阻止Smad2和Smad3磷酸化激活，从而对TGF-β1/Smad信号通路发挥抑制作用[12]；降低心肌组织中Smad7表达可促进心肌纤维化，Smad7过表达可促进心肌纤维化[13]。

CXXC5为一种新发现的具有CXXC型锌指结构域的蛋白质，唯一人类5q31染色体上，在心脏、肝脏、肺脏、前列腺、卵巢、粒细胞等不同组织和细胞中具有不同水平的表达，主要定位在细胞质和细胞核中[14,15]。CXXC5具有广泛的生物学功能，在成纤维细胞、成骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经干细胞、粒细胞等细胞的迁移和分化中发挥重要作用[16,17]；在细胞能量代谢、血管生成、细胞凋亡、信号转导中也具有重要作用[18,19]。CXXC5在多种疾病中的作用越来越受到关注，目前研究比较多的为恶性肿瘤，CXXC5在恶性肿瘤中作为一种潜在的肿瘤抑制因子[20]。CXXC5也参与纤维化的过程，在皮肤损伤修复过程中，CXXC5参与皮肤纤维化的形成，过表达CXXC5可降低α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ等的水平，敲低CXXC5可使皮肤伤口胶原合成增加，促进伤口愈合。

CXXC5在心肌纤维化中的作用尚不清楚。本研究发现在心房颤动心肌纤维化大鼠心肌组织中CXXC5水平降低，考虑CXXC5可能参与心房颤动心肌纤维化的过程；且心房颤动心肌纤维化心肌组织中Smad7水平降低，Ⅰ型胶原、TGF-β1水平升高。Ⅰ型胶原在心房纤维化时合成和分泌增加，Ⅰ型胶原含量可反映心房纤维化程度。因此由本研究结果分析心房颤动的纤维化和心房重构与TGF-β1/Smad7抑制性信号通路减弱有关。本研究对心房颤动心肌纤维化大鼠给予过表达CXXC5处理，发现过表达CXXC5可升高心房颤动心肌纤维化大鼠心肌组织中CXXC5和Smad7水平，降低Ⅰ型胶原、TGF-β1水平，分析CXXC5可能通过TGF-β1/Smad7信号通路进而抑制心房颤动心肌纤维化的过程。

综上所述，CXXC5水平下降可能是诱导心房颤动心肌纤维化的潜在机制，过表达CXXC5可能通过抑制TGF-β1/Smad7信号通路进而抑制心房颤动心肌纤维化，CXXC5有望成为心房颤动心肌纤维化的潜在靶点。