祛风除湿方对特应性皮炎小鼠炎性反应和皮肤屏障功能的影响及其作用机制

2020-09-29杨富金钱思宇刘德明史丙俊

国际检验医学杂志 2020年18期

江雪，杨富金，钱思宇，刘德明，史丙俊

(重庆市中医院/重庆市第一人民医院皮肤科，重庆 400011)

特应性皮炎(AD)是一种慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤疾病，其发病率有逐年增高趋势。在西方国家，AD 已经成为儿童的主要易患疾病，给患儿的家庭和卫生医疗系统带来了巨大的经济负担[1]。AD为多因素、多环节、多途径共同作用的一种多基因疾病，发病机制主要涉及遗传、免疫及环境3个方面，具体的致病机制尚不完全明确[2-3]。一方面，皮肤屏障功能的改变会对微生物定植的种类和数量产生影响，另一方面，定植在皮肤表面的微生物可通过多种途径诱发炎性反应并进一步破坏皮肤屏障，二者相互影响、共同参与AD的免疫炎性反应过程[4-5]。祛风除湿方由防风、荆芥、白鲜皮、生地、甘草组成，具有抗炎和抗过敏作用。本研究通过动物实验，对AD小鼠使用祛风除湿方进行治疗，探讨其对AD炎性反应和皮肤屏障功能的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 SPF级6～8周龄雌性Balb/c小鼠20只，体质量(17±3)g，由重庆医科大学动物实验中心提供，于重庆市口腔医院中心实验室动物实验中心25 ℃恒温、封闭、SPF清洁级饲养。

1.2仪器与试剂 AIRTECH超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，离心机、流式细胞仪(艾森生物杭州有限公司)，CK-MPA10多功能皮肤测试仪(德国CK公司)；小鼠白细胞介素(IL)-4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美生物有限公司)，小鼠IL-6 ELISA试剂盒(武汉华美生物有限公司)，小鼠血清免疫球蛋白E(IgE) ELISA试剂盒(美国R&D公司)，小鼠干扰素-γ(IFN-γ) ELISA试剂盒(美国R&D公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体(美国santa cruz公司)，IL-1β单克隆抗体(美国santa cruz公司)，凋亡相关的半胱氨酸肽酶14(Caspase-14)单克隆抗体(美国santa cruz公司)。

1.3治疗药物祛风除湿方：防风12 g、荆芥10 g、白鲜皮12 g、生地12 g、甘草6 g；蒸馏水600 mL浸泡3 h，高火煎煮至沸腾后改为温火煎煮至中药液浓缩为400 mL，然后再采用蒸馏法浓缩为260 mg/mL，用高温蒸汽法灭菌后于4 ℃保存备用。地塞米松：将1片剂量为0.75 mg的地塞米松溶于28.8 mL蒸馏水中制成地塞米松悬液，于4 ℃保存备用。

1.4方法

1.4.1动物分组将20只小鼠采用随机数字表法分为4组，分别为对照组、模型组、地塞米松组、祛风除湿方组，每组5只。

1.4.2模型制备 4组小鼠均背部剃毛(3×3)cm。除对照组外，其他3组分别在实验第1天、第4天、第8天、第11天给予1%的二硝基氯苯(DNCB)100 μL刺激耳部，分别在第15天、第18天、第21天、第25天、第28天给予0.5% 的DNCB 100 μL刺激背部剃毛区域。同时，从第15天开始，对照组和模型组每天给予2次0.3 mL双蒸水灌胃；祛风除湿方组给予7.83 g/(kg·d)祛风除湿方灌胃；地塞米松组给予0.59 mg/(kg·d)地塞米松悬液灌胃。实验持续至第29天时结束，实验前及实验后测量小鼠体质量，并观察小鼠一般情况。

1.4.3皮肤搔抓次数分别在第8天、第15天、第21天和第28天时于DNCB刺激30 min后统计4组小鼠搔抓剃毛区域的次数，统计时间为10 min，单次反复搔抓计为1次。

1.4.4经皮水分流失(TWEL)检测平展小鼠背部剃毛区域，使用Tewameter TM300探头轻触小鼠皮肤，待检测曲线稳定后继续检测30 s，然后读取数值，每只小鼠检测3次，取平均值。

1.4.5皮肤组织切片HE染色取小鼠剃毛区域皮肤组织置于10%多聚甲醛中固定过夜，将标本脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色，镜下观察。

1.4.6免疫组织化学法检测皮肤组织中TNF-α表达水平石蜡切片进行脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后微波抗原修复，参照免疫组织化学法试剂盒说明书进行检测。

1.4.7Western blot检测皮肤组织中TNF-α、IL-1β、Caspase-14表达水平收集小鼠剃毛区域皮肤组织，提取蛋白进行检测。按照Western blot步骤进行电泳、转膜；1∶200的TNF-α单克隆抗体、1∶250的IL-1β单克隆抗体、1∶50的Caspase-14单克隆抗体和1∶1 000的β-actin一抗孵育过夜；第2天用磷酸盐缓冲液洗膜(洗3次，每次5 min)；二抗室温孵育1 h；配制化学发光液，将膜浸泡于发光液中1 min，置于成像仪中自动曝光；采用ImageJ软件分析目的蛋白与内参的比值，即为相对表达水平。

1.4.8ELISA检测血浆IL-4、IL-6、IgE、IFN-γ表达水平采用ELISA进行检测，操作过程严格参照试剂盒说明书进行。

1.4.9实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测脾组织中IL-17A、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、转化生长因子-β(TGF-β)、叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)表达水平采用qRT-PCR检测，取小鼠脾组织，进行研磨，收集脾细胞，提取mRNA，反转录后进行qRT-PCR，引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。分析数据，结果采用相对定量法2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列

2 结果

2.14组小鼠造模区域皮肤情况比较除对照组外，其他3组小鼠造模区域表现为红斑、稍有水肿，伴有糜烂、结痂，皮肤表面粗糙，覆以少许糠秕样鳞屑；经药物治疗后，祛风除湿方组、地塞米松组小鼠造模区域症状明显改善，红斑面积、点状渗出减少，皮肤弹性恢复。 4组不同时间点搔抓次数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；除对照组外，同一组小鼠不同时间点搔抓次数比较，差异也均有统计学意义(P<0.05)，其中地塞米松组与祛风除湿方组第21天、28天时搔抓次数与模型组比较明显减少(P<0.05)，见表2。4组造模区域TWEL比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较，模型组TWEL明显升高(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组与祛风除湿方组TWEL明显降低(P<0.05)；地塞米松组与祛风除湿方组TWEL比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

表2 4组不同时间点搔抓次数比较次)

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.24组小鼠皮肤组织典型病理改变 HE染色200倍镜下观察，模型组皮肤组织棘层增厚，表皮突明显延长，并有角化过度及角化不全，在表皮内有轻度的细胞间水肿，真皮上部显示轻度血管周围炎性反应浸润，以淋巴细胞居多，毛细血管数目增多，内皮细胞肿胀、增多。地塞米松组和祛风除湿方组经药物治疗后可见皮肤表皮棘层变薄，角质层变薄，真皮层炎症细胞减少，皮肤炎性反应得到缓解，见图2。

2.34组小鼠皮肤组织中TNF-α、IL-1β、Caspase-14的表达情况与对照组比较，模型组TNF-α、IL-1β表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，祛风除湿方组TNF-α、IL-1β表达水平明显降低(P<0.05)，地塞米松组TNF-α表达水平明显降低(P<0.05)，见图3A、3B。模型组Caspase-14表达水平明显低于对照组、地塞米松组和祛风除湿方组(P<0.05)，见图3C。免疫组织化学法检测TNF-α的结果显示，对照组TNF-α染色面积较小，染色较弱，仅在真皮浅层有少量表达；模型组真皮层可见大量TNF-α表达，染色深；经药物治疗后，地塞米松组和祛风除湿方组真皮层TNF-α染色面积缩小，见图4。

注：A为对照组；B为模型组；C为地塞米松组；D为祛风除湿方组。

注：A为对照组TNF-α表达情况；B为模型组TNF-α表达情况；C为地塞米松组TNF-α表达情况；D为祛风除湿方组TNF-α表达情况。

2.44组IL-4、IL-6、IFN-γ及IgE表达水平比较与对照组比较，模型组IgE、IL-4、IL-6表达水平明显升高(P<0.05)，IFN-γ表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组和祛风除湿方组IgE、IL-4、IL-6表达水平明显降低(P<0.05)，IFN-γ表达水平明显升高(P<0.05)；地塞米松组和祛风除湿方组IgE、IL-4、IL-6、IFN-γ表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图5。

2.54组IL-17A、RORγt、Foxp3、TGF-β表达水平比较与对照组比较，模型组IL-17A、RORγt表达水平明显降低(P<0.05)，Foxp3、TGF-β表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，地塞米松组和祛风除湿方组IL-17A、RORγt表达水平明显升高(P<0.05)，Foxp3、TGF-β表达水平明显降低(P<0.05)；地塞米松组和祛风除湿方组IL-17A、RORγt、Foxp3、TGF-β表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图6。

注：A为4组IgE表达水平比较；B为4组IL-4表达水平比较；C为4组IL-6表达水平比较；D为4组IFN-γ表达水平比较；与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

注：A为4组IL-17A表达水平比较；B为4组RORγt表达水平比较；C为4组Foxp3表达水平比较；D为4组TGF-β表达水平比较；与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

AD发病原因复杂，与皮肤屏障的破坏、免疫失调导致皮肤炎性反应等均相关。反复发作的剧烈瘙痒和皮疹是AD的主要临床表现。地塞米松是临床上用于治疗AD急性发作的药物，对急性期瘙痒有较好的控制效果，但长期使用会出现明显的免疫抑制作用，因此临床上仅将其用于短期控制病情，在患者好转后均及时减量或停药。中药被用于治疗AD历史悠久，尤其是在预防疾病复发，保持长期缓解和减轻病情方面有较多优势。

祛风除湿方由防风、荆芥、白鲜皮、生地、甘草组成。方中白鲜皮苦寒，用以清热燥湿、解毒祛风；荆芥、防风祛风解表，透疹止痒；三药合用，可燥湿、祛风、止痒。此外，防风、荆芥含多种化学成分，具有抗炎和抗过敏作用，能抑制DNCB所致的迟发型超敏反应。甘草、白鲜皮也具有抗炎作用[6]。在皮肤屏障修复方面，本研究对药物治疗前后小鼠皮肤屏障功能进行观察，发现经祛风除湿方治疗的小鼠皮肤水分流失和瘙痒情况得到明显改善，且治疗效果与地塞米松相仿。进一步研究发现，与模型组比较，皮肤屏障修复相关的重要蛋白Caspase-14在祛风除湿方组中的表达水平明显升高。Caspase-14的分布具有皮肤特异性，主要参与表皮细胞的终末分化和皮肤屏障的形成，故考虑祛风除湿方对AD的治疗作用可能与其能够增加Caspase-14的表达相关。

AD作为一种过敏性皮肤疾病，对环境抗原的高度敏感性可能导致IgE合成增加，IgE的合成增加与皮肤损伤的严重程度有一定关联。研究表明，IgE水平升高可引起皮肤的急、慢性炎性反应，血清总IgE水平升高是AD的重要标志，并且与Th1、Th2细胞失衡相关[7]。 Th1细胞主要分泌IFN-γ，介导细胞免疫；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5等，介导体液免疫。本研究结果显示，与模型组比较，祛风除湿方组IgE、IL-4表达水平明显降低，IFN-γ表达水平明显升高，提示祛风除湿方可以降低机体的过敏反应，调节Th1、Th2细胞系统平衡。IL-6是炎性反应中重要的前炎症因子，介导炎性反应的发生、发展，经祛风除湿方治疗后的小鼠IL-6表达水平明显降低，提示祛风除湿方可以有效控制炎性反应的发生、发展。此外，地塞米松组和祛风除湿方组IgE、IL-4、IL-6、IFN-γ表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示在控制AD的炎性反应、过敏反应及免疫调节上，地塞米松和祛风除湿方的治疗效果无明显差异。

IL-1β是IL-1家族成员，也是重要的促炎因子，IL-1的活性主要由IL-1β介导。当机体受到过敏原刺激后可分泌大量的IL-1β，导致TNF-α的分泌增加，参与AD的发生、发展。TNF-α是一种多向性的促炎因子，由多种细胞分泌，可刺激单核-巨噬细胞进一步分泌IL-1β，促进炎性反应的发生。本研究结果显示，与模型组比较，祛风除湿方组IL-1β和TNF-α表达水平明显降低，提示祛风除湿方可以有效控制炎性反应的发生，缓解AD的临床症状，改善皮损情况。

AD在免疫失调方面主要表现为Th1、Th2细胞系统失衡。既往研究表明，Th2细胞的异常表达是AD的一个重要发病因素，但是在亚洲人群中，Th17细胞合并Th2细胞的异常表达更为突出[8]。Th17细胞通过分泌TNF-α、IL-17、IL-21、IL-22等细胞因子发挥生理和病理作用，可介导炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植物抗宿主反应的发生、发展[9-10]。IL-17是Th17细胞分泌的主要效应因子，可参与炎性反应相关疾病的发生、发展过程，其主要类型包括IL-17A和IL-17F。本研究中，与对照组比较，模型组IL-17A表达水平降低，提示Th17细胞在AD发生时处于一种抑制状态，IL-17A分泌减少。既往研究表明，Th17细胞的异常表达是AD的发病机制之一[11-12]。IL-17可通过刺激上皮细胞、成纤维细胞，参与AD的皮肤重塑过程[13-14]；AD病程发展为慢性时，Th17细胞又可分泌IL-17，对患者的皮肤屏障进行修复[15]。本研究中，与模型组比较，祛风除湿方组IL-17A表达水平升高，提示祛风除湿方可能通过调节IL-17A的表达水平来进行皮肤屏障修复，改善皮损情况。IL-17A和IL-17F在过敏反应中发挥的作用可能略有不同，而IL-17F的作用还需进一步研究证实。

TGF-β参与诱导调节性T细胞的产生和增殖，介导免疫抑制作用；AD患者外周血Foxp3、RORγt mRNA水平及血清中相应细胞因子水平发生变化参与了AD的发生、发展[10-11]；在TGF-β单独作用下，初始CD4+T细胞中Foxp3和RORγt均表达增加。本研究中，与对照组比较，模型组RORγt表达水平降低，Foxp3、TGF-β表达水平升高；与模型组比较，祛风除湿方组RORγt表达水平升高，Foxp3、TGF-β表达水平降低。提示祛风除湿方可能是通过调控RORγt、FoxP3、TGF-β的表达而达到免疫调节的作用。