UFLC-MS/MS法同时测定枳实中6个活性成分的含量

杨宝田，关 皎，贾 桐，朱鹤云

(1.吉林省白山市食品药品检验所，吉林 白山 134300；2.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

枳实(Aurantiifructusimmaturus)，又名酸橙，始载于《神农本草经》，列为中品，原文记载“枳实主大风在皮肤中，如麻豆苦痒，除寒热结，止利，长肌肉，利五脏，益气轻身，生川泽”。2015版中国药典记载枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破气消积、化痰散痞等功效[1]。枳实为“药食同源”类植物资源，广泛分布于四川、江西、福建、江苏等地区。枳实中含有的主要活性成分为黄酮类化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、异柚皮苷、柚皮素、橙皮素等，文献报道，枳实中的黄酮类成分具有抗炎、镇痛、降低毛细血管通透性、抗氧化等多种生物活性[2-5]。目前，针对枳实中黄酮类活性成分进行含量测定主要采用高效液相色谱法[6-9]，存在分析时间长、灵敏度低、专属性差等缺点，难以满足高通量样品分析的要求。近年来，超快速液相色谱-质谱联用(UFLC- MS/MS)技术由于具有灵敏度高、选择性强、定量准确、分析速度快等优点，越来越多的应用于中药的质量控制研究[10-11]。本试验建立UFLC-MS/MS法同时测定枳实中6个黄酮类活性成分(异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素)的含量，所建立的分析方法分析时间明显缩短，分析效率显著提高，可为枳实的质量评价提供科学依据，同时为天然药物应用于兽医兽药领域提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 3200 QTRAP质谱仪(配备电喷雾离子源，Analyst 1.5.1数据采集和定量处理软件，美国AB Sciex公司)；Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器、LC-20AD二元泵、CTO-20A柱温箱、SPD-20A紫外检测器和LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；KQ-250DE型数控声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA 225D型电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)；XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；FW80型微型高速万能试样粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料 柚皮苷对照品(批号：110722-201815)、橙皮苷对照品(批号：110721-201818)和新橙皮苷对照品(批号：111857-201703)，均购自中国食品药品检定研究院；异柚皮苷对照品(批号：16081802)、柚皮素对照品(批号：17061301)、橙皮素(批号：17072601)，均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。乙腈和甲醇为色谱纯(美国Fisher科技公司)，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。枳实药材，购自沈阳市国大药房，产地为四川省，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定为芸香植物酸橙(CitrusanrantiumL.)的干燥幼果，样品存留于吉林医药学院药学院中药样品室。

1.3 色谱条件 采用Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，预柱为C18保护柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，10%→30%B；10～12 min，30%→60%B；12～15 min，60%→85%B)，平衡时间为3 min，流速为0.5 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为5 μL。

1.4 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI源)，负离子方式检测，源喷雾电压5 500 V，辅助加热气温度550 ℃，雾化气、辅助气和气帘气压力分别为50 psi、50 psi和20 psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)，用于定量的离子反应分别为m/z579.1→m/z270.9(异柚皮苷)、m/z579.2→m/z271.0(柚皮苷)、m/z609.1→m/z301.2(橙皮苷)、m/z609.2→m/z301.1(新橙皮苷)、m/z301.1→m/z151.0(柚皮素)和m/z271.1→m/z150.9(橙皮素)。异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的碰撞能量(CE)分别为34、45、40、48、33 eV和26 eV。异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素混合对照品和样品的MRM色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和样品(B)MRM色谱图Fig.1 Mixed reference substance (A) and sample (B) MRM chromatogram1:异柚皮苷;2:柚皮苷;3:橙皮苷;4:新橙皮苷;5:柚皮素;6:橙皮素1:Isonaringin;2:Naringin;3:Hesperidin;4：Neohesperidin;5:Naringenin;6:Hespereti

1.5 溶液的制备

1.5.1 对照品溶液的制备 分别精密称取异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成异柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素质量浓度为0.1 mg/mL、柚皮苷和新橙皮苷质量浓度为1.0 mg/mL的单一成分对照品储备液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 供试品溶液的制备 精密称取枳实药材粉末(过40目筛)0.1 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声(功率250 W，频率50 kHz)处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。精密量取续滤液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2 结果

2.1 线性关系考察 分别精密吸取“1.5.1”项下的各对照品溶液适量，置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇配制成异柚皮苷浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，柚皮苷浓度分别为1、2、5、10、20 μg/mL和 40 μg/mL，橙皮苷浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，新橙皮苷浓度分别为0.5、1、2.5、5、10 μg/mL和20 μg/mL，柚皮素浓度分别为0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL，橙皮素浓度分别为0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL的系列混合对照品溶液。依次注入超快速液相色谱-质谱联用仪，测定峰面积。以对照品的浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积的积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得出异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的线性回归方程分别为：

Y=4.109×104X-4.544×103r=0.999 2

Y=2.640×104X+5.622×103r=0.999 4

Y=2.871×104X-3.552×102r=0.999 7

Y=6.469×104X+1.247×104r=0.999 2

Y=3.553×104X-2.849×102r=0.999 7

Y=7.043×104X+1.877×102r=0.999 7

结果表明，异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分别在0.2～8.0 μg /mL、1.0～40 μg/mL、0.2～8.0 μg/mL、0.5～20 μg/mL、0.02～0.8 μg/mL和0.02～0.8 μg/mL浓度范围之内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 精密度试验 精密吸取“2.1”项下制备的异柚皮苷质量浓度为2.0 μg/mL、柚皮苷质量浓度为10 μg/mL、橙皮苷质量浓度为2.0 μg/mL、新橙皮苷质量浓度为5 μg/mL、柚皮素质量浓度为0.2 μg/mL和橙皮素质量浓度为0.2 μg/mL的混合对照品溶液 200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上。按上述色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面积的RSD分别为2.6%、2.0%、2.7%、1.9%、1.6%和2.5%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，在室温下分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12 h和24 h 进样测定，记录峰面积。结果异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面积的RSD分别为2.7%、2.7%、2.9%、1.5%、1.4%和2.3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4 重复性试验 取同一批枳实样品6 份，分别按“1.5.2”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，进样测定，记录峰面积，计算待测成分的含量。结果异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量平均值(n=6)分别为1.87%、11.9%、0.471%、3.14%、0.373%和0.0418%，RSD分别为1.5%、2.3%、2.8%、2.2%、2.8%和2.5%，表明方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验 取已知含量的同一批次枳实样品9份，精密称定，每份0.05 g，分别加入相当于样品中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3份。按“1.5.2”项下的方法制备供试品溶液，进样5 μL测定，计算异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率和RSD值，结果见表1。

表1 枳实样品中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率Table 1 Recoveries of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin

2.6 样品含量测定 精密称取6批枳实样品，按“1.5.2”项下的方法制备供试品溶液，进样5 μL，每个溶液进样3次，计算异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量。6批样品测定结果见表2。

表2 枳实样品中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量Table 2 The contents of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin in Aurantii fructus immaturus (%)

3 讨论

3.1 色谱和质谱条件的优化 分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水4种流动相体系。结果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相体系能够获得较好的分离效果。6个待测物在电喷雾离子源负离子检测模式下的响应明显高于正离子模式，在负离子模式下异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分别形成m/z579.1、m/z579.2、m/z609.1、m/z609.2、m/z301.1和m/z271.1的[M-H]-准分子离子，灵敏度较高且信号较为稳定。碰撞能量(CE)对定量结果的影响较大，试验过程中对碰撞能量(CE)进行了优化，考察了10～50 eV范围内异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的质谱响应，结果表明，较低CE (10～20 eV)时，6个待测物形成各自稳定的碎片离子，产生的碎片离子较少，较高CE (20～50 eV)时，母离子信号进一步降低，但产生较多的碎片离子。因此，最终选择的异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的CE值分别为34、45、40、48、33 eV和26 eV。本试验同时对源温度(Source temperature)、源喷雾电压(Ionspray voltage)等参数进行了优化。采用本试验建立的UFLC-MS/MS分析方法测定枳实中6个活性成分时，分析时间仅为14 min，与文献[5-8]中采用的常规HPLC相比分析时间明显缩短，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定。

3.2 提取方法及提取溶剂的选择 本试验对比了回流法和超声法提取枳实中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的提取效果。结果表明，超声提取30 min所得供试品中上述6个活性成分的含量均明显高于回流提取法，因此，本试验采用超声提取法作为枳实中6个活性成分的提取方法。本试验对比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液对枳实中6个活性成分的提取效率，结果显示，100%甲醇的综合提取效率最高，故本试验采用100%甲醇作为提取溶剂。

3.3 本试验建立UFLC-MS/MS法同时测定枳实中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量，并应用该方法测定了6批枳实中上述6个活性成分的含量。本试验建立的UFLC-MS/MS方法简单、快速、灵敏、专属性强，可为枳实的质量控制和体内研究提供参考。