新疆阿勒泰地区牛结核病流行病学调查

罗鹏飞，王金泉

(新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛结核分支杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一类人兽共患传染病，其主要传播途径是呼吸道和消化道[1-2]。由于牛结核分支杆菌拥有广泛的宿主，尤其是牛只；如若病牛产生的牛奶未经消毒就被人类饮用，则有较大几率感染该病，同样，人类染病也可以经接触等途径传染给牛。对人结核病的发病原因统计，10%以上的原因都是由牛分枝杆菌导致[3-5]。该病在世界各地均有发生，且一年四季都可感染[6]；是世界动物卫生组织(OIE)规定通报的疫病，也是我国的二类疫病[7]。该疾病是国内外迫切需要解决的严重公共安全问题。

为有效控制牛结核病的流行，对新疆阿勒泰地区开展了结核病净化工作。为了解该地区结核病的防控效果，通过对2015-2019年连续5年的牛结核病流行病学监测，以期通过该数据制定更为精确的防控手段，为该地区的净化工作提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2015-2019年，在阿勒泰地区8个乡镇共计采集样品64 442份。

1.2 检测试剂 提纯牛型结核菌素：哈药集团生物疫苗有限公司；牛结核γ-干扰素ELSIA检测试剂盒：青岛瑞尔生物技术有限公司；DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker：TaKaRa 公司；2×EcoTaqPCR SuperMix：北京全式金生物技术有限公司。

1.3 检测方法 采样数据从2015年开始统计，先对该年份的所有牛只进行牛型结核菌素皮内变态反应(PPD)普检，将阳性牛、可疑牛只采集抗凝血，可疑牛只进行二次检测，二次检测仍为可疑则定为阴性。通过PPD检测结果，随机采集部分阴性牛血液，与阳性牛及二次检测均为可疑牛只的抗凝血进行牛结核γ-干扰素ELISA试验和PCR检测，并对结果进行分析，选择特异性最优的检测方法对2016-2019年采集的牛进行结核病检测。

1.3.1 牛型结核菌素皮内变态反应(PPD) 按照国标《动物结核病诊断技术》(GB/T18645-2002)[8]进行，分别于注射前和注射后12、24 h和72 h测量皮肤厚度，并计算出皮厚差，按国标统计PPD结果。

1.3.2 牛结核γ-干扰素 ELISA 试验 采集抗凝血24 h内送回实验室，按照说明书进行检测。

1.3.3 PCR方法检测 将抗凝血按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，PCR参照段旭基等[9]牛结核杆菌和结核分枝杆菌IS1081基因(IS-1：5′-CGACGCTCTGACCGACAAACT-3′；IS-2：5′-TGCTTGGCGGGTTCTTCG-3′；324 bp)扩增目的片段；PCR扩增体系为：95 ℃ 5 min；(94 ℃，2 min；58 ℃，1.5 min；72 ℃，2 min)35个循环；72 ℃ 10 min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增结果阳性产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，用NCBI提供的BLAST软件进行比对分析。

1.4 数据分析 文中Kappa系数计算公式如下：

其中，Po为观察符合率，Pe为机遇符合率。

2 结果

2.1 3种试验方法的符合分析 用PPD试验对12 115头牛进行普检，对可疑牛只进行复检，最终确定25头牛为阳性牛，3头二次结果均为可疑品。阳性牛未表现出明显临床症状。随机抽取阴性牛血样131份(包括二次结果均为可疑的3个样品)，总计156份样品，进行牛结核γ-干扰素ELISA试验和PCR检测。

经IS1081基因引物扩增后，共有27份牛血DNA中扩增出目的片段，约324 bp，大小符合预测值(图1)，经测序比对，确认为牛结核杆菌。

图1 牛结核杆菌 IS1081基因序列扩增结果Fig.1 Amplification results of IS1081 gene of bovine tuberculosisM：DL-2 000 DNA Marker；1～5：牛结核杆菌样本；6：阳性对照；7：阴性对照M：DL-2 000 DNA Marker；1～5:Samples of Mycobacterium bovis tuberculosis;6:Positive control;7:Negative control

表1 PCR方法、γ-干扰素 ELISA方法与PPD方法检测结果Table 1 Results of PCR,γ-interferon ELISA and PPD

PCR检测出阳性27份，阴性129份，阳性率为17.31%；PPD检测阳性为25份，阴性131份，阳性率为16.03%，Kappa值为0.83。γ-干扰素ELISA检测阳性26份，阴性130份，阳性率为16.67%，Kappa值为0.88。Kappa≥0.8，检验结果一致性很好。综合分析，最终决定用PCR方法进行2016-2019年的流行病学调查。

对阿勒泰地区2015-2019年牛结核病检测结果进行统计。从2015-2019年试验结果(表2) 可看出，牛结核病总平均阳性率为0.18%，从2015年的0.22%降至2019年的0.09%；其中，2015年阳性检出率最高，达到0.22%(27/12 155)。此次结果表明，近5年阿勒泰地区牛结核病阳性率呈现下降趋势。

表2 2015-2019年牛结核病检测结果Table 2 Test results of bovine tuberculosis in 2015-2019

2.2 不同地区牛结核病监测结果 对该地区5年间的不同乡镇牛结核病进行统计(见表3)。从表3可以看出，5年内共计调查64 442头牛，阳性114头，平均阳性率为0.18%。其中，C乡镇的阳性率为0.02%(1/6 531)；其余乡镇阳性率分别为A(0.25%，20/8 125)、B(0.18%，14/7 988)、D(0.16%，15/9 217)、E(0.22%，23/10 336)、F(0.13%，7/5 475)、G(0.19%，16/8 512)及H(0.22%，18/8 258)。此次检测结果表明，阿勒泰地区8个镇(乡)牛结核病防控效果存在明显差异。除C乡镇(0.02%)外，其余7个乡镇的阳性率均高于农业部净化标准(0.05%)，防控形势依然严峻。

表3 2015-2019年不同地区牛结核病监测结果Table 3 Results of bovine tuberculosis in different regions from 2015 to 2019

3 讨论

牛型结核菌素皮内变态反应(PPD)是国际推荐的诊断方法。其优点是该方法对人员的专业水平要求低，简单培训就能操作[10]，且结核菌素抗原便宜，易于推广；但是该方法操作步骤繁琐，耗时耗力，非特异性反应经常出现，重复性不好。γ-干扰素 ELISA 试验可以检测早期感染牛只，特异性较好，易于标准化；但是γ-干扰素ELISA试验需在采血后24 h内检测[11]，且试剂盒的成本较高。PCR方法同样具有高敏感性和强特异性，尤其是一些临床症状不明显的隐性感染等[9,12]；且牛分枝杆菌IS1081具有高度的种属特异性；PCR检测的重复性较好，人为因素相对较小。目前，PPD仍为我国检疫标准，其他方法都是辅助手段，但是在实际操作中，可以根据实际情况灵活选择。本试验经综合考虑，采用PCR方法对2016-2019年牛结核病进行结核病检测，掌握阿勒泰地区牛结核病流行情况和分布特点。

2015-2019年阿勒泰地区牛结核病总阳性率为0.18%，且每年呈下降趋势；该病的下降趋势主要与采取强制扑杀阳性病牛政策措施有关。此数据与盖守睿对2009-2013年的监控数据相似[13]。近年来，阿勒泰地区兽医部门高度重视，不断增加经费投入，提高扑杀补助标准，强制扑杀阳性牛，并将尸体及相关产品无害化处理，切断传染源，对快速净化牛结核病起到了至关重要的作用。从监测结果来看，自2019年防控措施加强后，阳性率有了明显的下降，虽未达到农业部净化标准(0.05%)，但防控措施仍然不可懈怠，应引起密切关注，防止疫病反弹。

对阿勒泰地区不同乡镇牛结核病监测结果来看，7个乡镇的阳性率均高于农业部标准，不同乡镇间牛结核病防控效果存在明显差异，可能是由于该数据是一个综合数据，为5年间该地区的总感染率，且调查样品来自不同规模的养殖场，各养殖场的防控意识有所差别，故不同乡镇的防控结果存在区别。C乡镇的规模养殖场较多，且防控意识较高，故该地区5年仅发现1例阳性。而A乡镇自繁自养居多，且牲畜交易频繁，应加强该地的监控及防控措施。

为今后有效控制净化该病，相关部门应不断完善病牛的扑杀补偿机制，增强该病的监督和保障机制；并且加强动物检疫工作，发现阳性病牛应立即扑杀并做好无害化处理[14]。对外来牲畜的检疫工作不容忽视，严禁感染牛只引入。由于结核病为人兽共患病，可与人结核病交叉感染，一定要增强畜主的防范意识，避免交叉感染。