塞内卡病毒A间接ELISA检测方法的建立及应用

王彩霞，张 舟，范燕茹，冯春燕，吴绍强，林祥梅

(1.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 大兴 100176；2.河南城建学院生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036)

2002年，研究人员发现了一种名为塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)的新病毒，将其归类为一个新的病毒属，其唯一的代表株是塞内卡病毒A(Senecavirus A，SVA)[1]。SVA感染后可引起猪鼻镜及蹄冠等处出现水疱、溃烂创面，偶见发烧及腹泻，可导致新生仔猪发生急性死亡，给养猪业带来巨大经济损失[2]。截止到目前为止，美国、加拿大、中国、巴西、哥伦比亚、泰国等多个国家已经报道了多起SVA感染猪的病例[3-7]，这引起了国内外众多研究者的重视。目前，国内外已经建立了多种针对SVA的检测方法，例如RT-PCR检测方法[8]、荧光定量PCR方法[9]、原位杂交检测方法[10]、反转录重组聚合酶常温扩增技术(RT-RPA)快速检测方法[11]、ELISA检测方法[12]等。其中ELISA方法因其原理简单，操作简便，灵敏，快速，适用性广泛，成为血清学诊断技术中的常用技术手段，但筛选一个理想的检测抗原是ELISA方法研究中的重中之重。本研究将VP2和VP3全长基因克隆到表达载体上，诱导表达为一个组合重组蛋白，暂记为VP2/3，通过优化反应条件建立了针对VP2/3蛋白的间接ELISA方法，并进一步利用该ELISA方法检测人工感染SVA后不同时间采集的猪血清样品，绘制了猪体感染SVA后VP2/3蛋白抗体的消长规律，以便为后续相关疫苗免疫程序的制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SVA分离株GD01/2017(GenBank登录号：MH316114)由扬州大学兽医学院江苏省动物预防医学重点实验室惠赠。猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病等阳性血清本实验室保存。载体pET30a(+)、感受态DH5α和BL21 (DE3)，由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所实验室保存。

1.2 主要试剂 DL-2 000 DNA Marker、pMD 18-T载体、低分子蛋白Marker、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA琼脂糖树脂和病毒RNA提取试剂盒，均购自Qiagen公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物及血清 20日龄SPF猪，购自北京市SPF猪育种管理中心，攻毒剂量为109TCID50/头猪，攻毒前采样记为第0天，攻毒后的第1～14天每天采样，样品标记为D1、D2……D14，攻毒后第6天进行二次攻毒，在二次攻毒后的第11、14、18天采样，样品标记为D16、D19、D23。同时设立SPF猪血清对照组，并在同样时间采集血清样品。SVA阳性对照血清和SPF猪阴性对照血清，由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所实验室保存。

1.4 序列分析、合成及引物设计 根据SVAGD01/2017分离株(GenBank登录号：MH316114)VP2、VP3基因序列设计1对引物，并在基因两端加入EcoRⅠ、XhoI酶切位点。引物序列为：VP23F：5′-CGCGAATTCGATCACAATACCGAAGA-3′(下划线处为EcoR I识别位点)；VP23L：5′-ATACTCGAGGTGGAACACGTAGGAAGG-3′(下划线处为XhoI识别位点)，预期扩增片段大小为1 569 bp。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.5 原核表达载体的构建 利用病毒RNA提取试剂盒提取SVA GD01-2017分离株RNA，以该RNA为模板，用引物VP23F和VP23L通过RT-PCR扩增目的基因序列，琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收目的片段。将回收的目的片段和pET-30a (+) 载体分别进行EcoRⅠ和XhoI双酶切，电泳回收VP2/3和载体片段，将二者用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，转化BL21 (DE3) 感受态，筛选表达菌。经测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET-30Ba-VP2/3。

1.6 VP2/3的原核表达 分别取阳性菌液100 μL，接种2管卡那霉素抗性的液体LB中，每管10 mL培养基，培养至OD600值在0.4～0.6时，分别取菌液1 mL为诱导前对照，然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，1管菌液20 ℃诱导过夜，1管37 ℃诱导过夜，同时设pET-30a (+) 诱导菌为空白对照。

1.7 重组蛋白的SDS-PAGE分析 取诱导后的pET-30a-VP2/3菌液离心后弃上清，用 PBS 重悬后超声裂解分离上清和沉淀，分别取不同诱导条件下表达的适量上清和沉淀制备SDS-PAGE样品，同时以pET-30a (+) 作为对照,进行SDS-PAGE电泳。

1.8 VP2/3蛋白的大量表达及纯化 将pET-30a-VP2/3菌液接种200 mL培养液中，37 ℃大量诱导表达目的蛋白。离心收集菌体沉淀后，超声裂解，离心洗涤包涵体，去除杂蛋白，收集VP2/3包涵体蛋白，参照文献[13]中的方法对包涵体蛋白进行处理，并以Ni+柱亲和层析纯化VP2/3蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，并取2 μL纯化蛋白制样进行SDS-PAGE检测，其余蛋白分装后-80 ℃保存备用。

1.9 以VP2/3蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法

1.9.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 将VP2/3蛋白用包被液稀释成0.000 1 μg/μL，0.000 5 μg/μL，0.001 μg/μL，0.002 μg/μL，0.004 μg/μL，0.006 μg/μL，0.008 μg/μL，0.01 μg/μL，然后每孔100 μL包被酶标板，4 ℃包被过夜。SPF猪血清和SVA阳性血清按1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160倍稀释。采用棋盘滴定法计算每个反应条件下的P/N值，P/N值最大的反应组合作为间接ELISA的最佳反应条件。

1.9.2 间接ELISA工作条件的优化 在37 ℃条件下分别采用1%BSA，2%BSA，5%BSA，4%羊血清，2%马血清封闭1 h确定最佳封闭液；酶标二抗分别按1∶500，1∶1 000，1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶4 000稀释，确定最佳二抗稀释浓度。TMB室温显色15 min，2 mol/L H2SO4终止显色。

1.9.3 间接ELISA方法的特异性检测 采用所建立的ELISA方法对猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病等阳性血清进行检测，同时设SVA阳性血清和SPF猪血清作为对照，以检测该方法的特异性。

1.10 人工感染SVA后猪体VP2/3抗体的消长规律研究 采用本研究所建立的ELISA方法检测人工感染SVA后不同时间采集的猪血清样品，根据检测结果绘制抗体消长规律图。

2 结果

2.1 重组表达质粒的构建及表达 以提取的SVA全RNA为模板扩增出VP2/3目的基因，经EcoR I和XhoI双酶切后与pET30a(+)片段连接构建重组表达质粒。经测序正确的阳性质粒用于后续原核表达。对不同诱导条件下的菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE检测(图1)，结果表明，蛋白无论是低温诱导还是高温诱导均以包涵体形式表达，高温诱导时蛋白的表达量较高，蛋白大小为66 kD，与预期大小一致。

2.2 包涵体蛋白VP2/3的纯化 大量诱导表达后收集菌体沉淀，按照文献中的方法对包涵体蛋白进行洗涤并纯化，测定蛋白浓度为5.3 mg/mL，取2 μL纯化蛋白制样进行SDS-PAGE检测，结果见图2，纯化后的VP2/3蛋白比较纯，可以用于后续试验。

图2 纯化的包涵体蛋白的SDS-PAGE检测结果Fig.2 The detected result of purified inclusion body by SDS-PAGE

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定 通过棋盘滴定法确定了最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数，检测数据见中插彩版图3，当VP2/3抗原包被浓度为0.2 μg/孔，一抗血清稀释度为1∶80时，P/N值最大，因此将其确定为该ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数。

2.3.2 最佳封闭液的确定 封闭液的优化结果见图4，从图中我们可以看出，在其他条件相同的情况下，当以1%BSA封闭时，P/N值最大，因此，选择1%BSA作为该ELISA方法的最佳封闭液。

图4 最佳封闭液的确定Fig.4 Determination of the sealing buffer

2.3.3 最佳酶标抗体稀释度的确定 HRP标记的兔抗猪抗体分别按照1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶4 000的稀释度稀释后进行ELISA检测，检测结果见图5，可见当酶标抗体为1∶2 000时P/N值最大，由此确定该ELISA方法的最佳酶标二抗稀释度为1∶2 000。

图5 最佳兔抗猪HRP酶标二抗稀释度的确定Fig.5 Determination of the anti-antibody

2.3.4 ELISA方法的特异性检测 以本研究所建立的ELISA方法对猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等阳性血清进行检测，同时设置阴阳性对照，检测结果见表1，其他相关病毒检测结果均为阴性，这表明该方法具有良好的特异性，与其他猪相关病毒无交叉反应。

表1 ELISA方法的特异性检测结果Table 1 The specificity result of ELISA method

2.4 感染SVA后猪体VP2/3蛋白抗体的消长规律研究 利用本研究所建立的ELISA方法检测人工感染SVA后不同时间采集的猪血清样本，根据ELISA检测结果绘制VP2/3蛋白抗体消长规律曲线图(图6)。从图中可以看出，在病毒感染后，第6天左右抗体滴度显著升高，第8～9天达到最高，并且在6～9 d时抗体滴度呈现线性上升，第9天以后抗体滴度逐步下降，直至第1次攻毒后的第23天，抗体降至SPF猪正常水平。

图6 人工感染SVA后猪体的VP2/3抗体消长规律图Fig.6 Law of growth and decline on VP2/3 antibody caused by artificial infection

3 讨论

SVA基因组为单股正链RNA，只有1个ORF，在病毒编码蛋白酶的作用下，可裂解成先导蛋白(L)和P1，P2，P3三个蛋白中间体，P1可进一步裂解成VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白，P2可裂解成2A、2B、2C三种非结构蛋白，P3可裂解成3A、3B、3C、3D四种非结构蛋白[14-16]。其中VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成SVA的衣壳蛋白，具有较强的抗原性，可以刺激动物机体产生特异性免疫反应，是塞内卡病毒主要的诊断靶抗原[12,17-18]。目前，A型塞内卡病毒的蛋白成熟机制并不十分清楚，P1前体是否与其他小RNA病毒一样剪切成VP1、VP2、VP3、VP4或者以其他形式发挥功能，仍然有待于进一步的研究证实。Dvorak C M等的研究结果表明，SVA早期感染即出现临床症状后0～4 d，ELISA方法比IFA方法更敏感[12]，而且VP2蛋白比VP1蛋白更加保守，更适合用于血清学检测[19-20]，本研究室前期已经进行了结构蛋白VP2的克隆表达并验证了其抗原性[18]。本研究将VP2和VP3全长基因进行了扩增，重组表达了塞内卡病毒A组合蛋白VP2/3，建立了针对VP2/3的间接ELISA检测方法，为今后SVA检测抗原的筛选提供了理论依据，并且为SVA 的快速诊断以及流行病学调查提供了技术手段。通过试验最终确定，本研究所建立的SVA VP2/3 间接ELISA检测方法的最佳检测条件为：以VP2/3蛋白0.2 μg/孔，4 ℃包被过夜，PBST洗3次，每次5 min；1%BSA 37 ℃封闭1 h，PBST洗3次，每次5 min；一抗阳性血清稀释度1∶80，37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，每次5 min；兔抗猪HRP标记二抗稀释度为1∶2 000，37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，每次5 min；TMB显色15 min，终止后OD450nm值读数，分析数据。

有研究表明，VP2和VP3可能具有SVA早期感染中和抗体的识别位点[21]，研究其抗体消长规律对疫苗免疫程序的制定具有重要的指导意义。因此本研究应用所建立的VP2/3 ELISA检测方法，进一步研究了SVA攻毒后不同时间采集的猪血清样品中VP2/3抗体的消长规律。从研究结果可以看出，在病毒感染后，第4天感染猪出现临床症状，第6天左右抗体滴度显著升高，第8～9天达到最高，表明病毒感染后8～9 d抗体滴度最高。同时从结果也可以看出，6～9 d抗体滴度呈现线性上升，从侧面进一步验证了VP2/3间接ELISA方法可用于SVA抗体的检测。第9天以后，抗体滴度逐步下降，持续监测显示，第14天左右抗体出现小波动，滴度再次出现轻微上升，推测与第6天二次攻毒相关。第1次攻毒的第23天后，抗体降至SPF猪正常水平。

综上，本研究建立了基于结构蛋白VP2/3的SVA间接ELISA的检测方法，为SVA检测抗原的筛选提供了依据；并进一步利用该方法检测了攻毒样品，结果显示攻毒后的第8～9天，VP2/3的抗体滴度达到最高，为后续疫苗免疫程序的制定提供了一定的理论依据。