洋蓟素对对乙酰氨基酚诱导的大鼠药物性肝损伤的影响①

张晓文 郑思琪 马应卓 李 帆 李娟芳 (商洛学院，商洛 726000)

药物诱导的肝损伤是指通过某些药物或其代谢物诱导的急性或慢性肝损伤，如今，药物性肝损伤已成为急性肝损伤的最常见原因，也导致了药物不良反应[1]。严重的肝损伤可能导致肝功能衰竭甚至危及生命，因此，针对药物性肝损伤寻找一种效果显著且安全的药物是十分重要的。对乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)常用做解热镇痛药，当以治疗剂量使用时，它是安全有效的，然而，由于过度使用APAP，实验动物和人类均可诱发严重的肝损伤[2]。由于其常见和实验简单，目前广泛用于临床建立药物性肝损伤动物模型[3]。洋蓟素又称朝蓟素，洋蓟酸，是提取自中药菜蓟的一类咖啡酰奎宁酸类化合物，具有抗氧化、抗微生物、利胆和保肝作用[4]。其利胆和保肝作用通常与洋蓟素的含量有关[5]。目前尚未有研究发现关于洋蓟素对药物性肝损伤是否具有治疗作用。本文旨在研究洋蓟素对APAP诱导的大鼠药物性肝损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 60只SD大鼠购自广东省医学实验动物中心，雄性，12周龄，体质量(200±10)g，许可证号：SCXK(粤)2018-0002，置于温控(22±1)℃和光控(200 lux，12 h光暗循环)动物设施中常规饲养7 d。

1.1.2药物与主要试剂 洋蓟素购自美国Sigma-Aldrich，化学式：C25H24O12，分子量：516.45，纯度≥98.0%；APAP购自中国食品药品检定研究院；N-乙酰半胱氨酸购自上海晶都生物技术有限公司；苏木素伊红染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；天门冬氨酸氨基转移酶测试盒、丙氨酸氨基转移酶测试盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、一氧化氮测定试剂盒、总超氧化物歧化酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶均购自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒均购自美国Abcam公司。

1.1.3仪器 酶标仪(318C+)购自上海沛欧分析仪器有限公司；可见分光光度计(V-1500PC)购自上海添时科学仪器有限公司；荧光显微镜(DYF-680)购自上海点应光学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立和分组 将大鼠随机分为6组：对照组(Control)、模型组(Model)、洋蓟素低剂量组(Cynarin 50)、洋蓟素中剂量组(Cynarin 100)、洋蓟素高剂量组(Cynarin 150)、N-乙酰半胱氨酸组(N-NAC)。洋蓟素组尾静脉注射APAP300 mg/kg，每日灌服洋蓟素10 ml(50、100、150 mg/kg)或N-乙酰半胱氨酸(100 mg/kg)，连续28 d。Model组尾静脉注射APAP(300 mg/kg)，每日灌服生理盐水。Control组尾静脉注射生理盐水(300 mg/kg)，每日灌服等量生理盐水[6]。

1.2.2肝重/体重比 模型建立后，称量各组大鼠体重，记为大鼠初始体重，模型建立28 d后，称量各组大鼠体重，记为终末体重，计算大鼠增重。处死大鼠，取肝组织称重，计算肝重/体重比。

1.2.3HE染色 将肝组织用10%福尔马林固定并进行石蜡包埋切片，苏木素伊红染色，将石蜡切片脱蜡，蒸馏水润湿组织，核染液染色5 min，水洗 5 s，浆染液染色30 s，水洗后，滤纸吸干，无水乙醇脱水2次后封片，在荧光显微镜下观测。并参照文献[7]方法进行肝损伤病理评分。

1.2.4血清中ALT、AST、AKP和NO测定 按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮(NO)水平。ALT、AST在510 nm 处测OD值，AKP在520 nm处测OD值，NO在550 nm处测OD值。

1.2.5ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，100 μl/孔置96 孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100 μl不同稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，用酶标仪测定。

1.2.6肝匀浆中SOD、MDA和GSH测定 按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定总超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可见分光光度计测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm处测OD值，MDA在532 nm处测OD值，GSH在412 nm处测OD值。

1.3统计学分析 使用统计软件SPSS17.0对实验数据进行分析。对实验数据进行正态分布分析和方差齐性分析，符合条件的选用单因素方差分析或t检验，不符合条件的选用秩和检验。

2 结果

2.1洋蓟素降低大鼠肝重/体重比 检测各组大鼠体重和肝重结果如表1所示。Model组终末体重显著高于Control组(P<0.05)，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组终末体重均显著高于Model组(P<0.05)；Model组体重增量显著低于Control组(P<0.05)，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组体重增量显著高于Model组(P<0.05)；Model组肝重显著高于Control组(P<0.05)。Model组肝重/体重比显著高于Control组(P<0.05)，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组肝重/体重比均显著低于Model组(P<0.05)。

表1 各组大鼠体重和肝重测定结果

2.2洋蓟素改善大鼠肝组织病理损伤 HE染色检测各组大鼠肝组织病理损伤结果如图1所示，与Control组相比，Model组肝组织肝索紊乱，炎症细胞浸润，细胞空泡样变性，病理损伤评分显著升高(P<0.05，表2)。Cynarin 50、100、150组和N-NAC组病理损伤程度较Model组有所减轻，炎症细胞浸润减少，空泡样变性减少，病理损伤评分显著降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠肝组织损伤病理评分

图1 HE染色

2.3洋蓟素降低血清中AST、ALT、AKP、NO水平 与Control组相比，Model组血清中AST、ALT、AKP、NO水平显著降低(P<0.05)，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组血清中AST、ALT、AKP、NO水平均显著低于Model组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中的各项指标测定结果

2.4洋蓟素下调血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 Model组TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著高于Control组(P<0.05)，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著低于Model组(P<0.05)。见表4。

表4 血清炎症因子水平

2.5洋蓟素对大鼠肝组织中SOD、GSH、MDA含量的影响 与Control组相比较，Model组SOD、GSH显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。与Model组相比较，Cynarin 50、100、150组和N-NAC组SOD、GSH含量显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。见表5。

3 讨论

药物性肝损伤是指由各种处方药或非处方药诱发的肝损伤，包括小分子化学药物、生物制剂、中药、天然药物、保健品和膳食补充剂等[8]。目前对药物性肝损伤仍缺乏简便、客观、特异的诊断指标和特异的治疗方法。APAP是研究最多的药物之一，导致可预测的药物性肝损伤，其肝毒性呈剂量依赖性[9]。到目前为止，N-NAC是治疗APAP诱导的药物性肝损伤最重要的疗法。然而，如果不及时治疗，患者通常需要进行肝移植[10]。已有研究证明洋蓟素具有保肝活性，本文研究发现，洋蓟素可降低大鼠肝组织病理损伤程度，降低大鼠肝重/体重比。

药物性肝损伤一般表现为肝脏生化指标水平升高，血清中ALT、AST、AKP属于药物性肝损伤的生物标志物[11]。NO是肝细胞氧化还原生物学中至关重要的活性氮物种，在APAP中毒时，肝组织中NO的合成增加[12]。Huang等[13]研究发现金丝小枣通过降低AST，ALT和AKP水平保持肝细胞的结构完整性并减轻APAP诱导的肝损伤。尹学哲等[14]研究发现草苁蓉不同溶剂萃取物通过降低一氧化氮合酶活性和NO水平对APAP诱导的小鼠急性肝损伤发挥保护作用。本研究发现，洋蓟素可降低AST、ALT、AKP水平的作用。

在APAP诱导的急性肝损伤下，活化的肝巨噬细胞将释放各种促炎细胞因子，包括TNF-α、IL6和IL-1β，这些促炎细胞因子能增强炎症反应和增加免疫细胞，如单核细胞和中性粒细胞的流入[15]。本研究发现，洋蓟素可降低TNF-α、IL6和IL-1β水平。

过量的乙酰氨基酚转化为NAPQI后，与组织大分子共价结合并氧化脂质，导致肝毒性，而脂质过氧化会导致膜破裂，导致膜完整性丧失和微粒体酶渗漏。GSH在线粒体抗氧化防御中起关键作用，且NAPQI诱导的耗竭是APAP诱导的毒性中的重要事件。MDA是脂质过氧的终产物通常用作氧化应激的生物指示剂，SOD是保护活性氧反应的重要酶，在APAP诱导期间，SOD活性较低[16]。Yan等[17]研究发现膳食α-Mangostin通过增加GSH含量，降低MDA含量对APAP诱导的肝毒性具有保护作用。Liu等[18]研究发现马齿苋乙醇提取物通过增加GSH水平、SOD活性，降低MDA含量改善对APAP诱导的肝损伤。本研究发现，洋蓟素有增加SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。

综上所述，在对APAP诱导的药物性肝损伤中，洋蓟素可改善肝组织病理损伤程度，降低肝脏生化指标水平、血清炎症因子水平，改善氧化应激水平。本文研究结果阐明了洋蓟素治疗药物性肝损伤的潜力，但具体的分子机制仍需进一步实验研究。