HPLC-UV法测定人血浆中替考拉宁药物浓度的方法学研究及其临床应用

王彦改，沈 芊，苏，王雪梅，姜德春，闫素英（首都医科大学宣武医院药学部，北京 100053）

替考拉宁对革兰阳性菌，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcus aureus，MRSA）造成的感染有很好的疗效[1]。替考拉宁治疗革兰阳性菌感染的疗效与万古霉素相当，但替考拉宁在相同条件下比万古霉素安全性更高[2]，其更容易渗透入组织和细胞，半衰期延长，肌内注射能良好的吸收[3]，临床主要用于多重耐药革兰阳性菌感染。有研究[4]表明，在临床应用过程中，有近70%的患者未达到最佳治疗浓度，而增加剂量会有不良反应的发生[5]，因此有必要进行血药浓度监测，以保证疗效，降低不良反应。替考拉宁的含量测定方法包括HPLC法[6-9]、LC-MS法[10]和荧光免疫偏振法[11]，其中HPLC法在生物样品含量测定方面的应用较多，检测波长多设在210～220 nm，本研究采用240 nm检测波长，以减少血浆中物质的干扰，提高检测的准确性。本研究拟通过建立灵敏、简单、快捷的替考拉宁血药浓度监测方法，为临床替考拉宁合理应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司），包括：LC-20AD二元泵、SIL-20AC进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A检测器、LabSolutions工作站；Biofuge pico离心机（德国贺力氏仪器公司）；旋涡混合器VORTEX-5（中国其林贝尔公司）；GZ-1多用震荡器（北京电机厂）；海科DCY-24S氮气吹干仪（青岛海科仪器有限公司）；XS205天平[瑞士梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试药

替考拉宁标准品（中国食品药品检定研究院，纯度/效价：每毫克相当于894单位，批号：130374-201002）。哌拉西林钠标准品[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，纯度：98.0%，批号：5C80B-NE]。乙腈和甲醇均为HPLC级（美国Fisher公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸（H3PO4）、二氯甲烷（CH2Cl2）均为分析纯（北京化工厂）。注射用替考拉宁（规格：200 mg，生产厂家：Sanofi-aventis S.p.A公司，批号：8714）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：kromasil ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾水溶液（25∶75，v/v），流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样池温度4 ℃，进样体积 20 μL，检测波长240 nm。

2.2 标准溶液和质控样本的配制

2.2.1 替考拉宁标准溶液的配制 精密称取替考拉宁标准品10.04 mg，用灭菌注射用水溶解后转移至5 mL容量瓶中定容，即配制成质量浓度为2.01 mg·mL-1的储备液。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取哌拉西林钠对照品2.55 mg，用灭菌注射用水溶解后转移至10 mL容量瓶定容，即得质量浓度为255 μg·mL-1的哌拉西林钠内标溶液。

2.2.3 标准曲线配制 精密吸取替考拉宁标准溶液50 μL，加入空白血浆950 μL配制成浓度为100.00 μg·mL-1的样品A，取空白血浆依次等比例（1∶1）稀释，配制成浓度分别为50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 μg·mL-1的样品B、C、D、E、F。

2.2.4 质控样品配制 精密吸取替考拉宁标准溶液50 μL，加入空白血浆950 μL配制成浓度为100.00 μg·mL-1的样品A，取空白血浆依次等比例（1∶2）稀释，配制成浓度分别为33.33、11.11、3.70 μg·mL-1的高浓度质控样品、中浓度质控样品、低浓度质控样品。

2.2.5 0.01 mol·L-1KH2PO4缓冲溶液 准确称取1.360 1 g KH2PO4转移至烧杯中，加入1000 mL灭菌注射用水。充分混匀，获得0.01 mol·L-1KH2PO4溶液,加入H3PO4调pH值2.8，抽滤待用。

2.3 血浆样品处理方法

取空白血浆、标准曲线及质控血浆样品400 μL置于1.5 mL离心管中，加入50 μL内标溶液（255 μg·mL-1），加入乙腈600 μL，涡旋1 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液于另一1.5 mL离心管中，再加入400 μL二氯甲烷萃取，涡旋1 min，12 000 r·min-1离心5 min后，取上清液进样分析，进样量20 μL。

where ω is the central angular frequency. Based on Eqs. (2)and (3), the parameter values of C1 and L can be obtained as,

2.4 方法学验证

方法学考察按照2015版药典中的生物样品定量分析指导原则[12]进行，包括专属性、残留效应、定量下限、标准曲线、准确度、精密度、稳定性。

2.4.1 专属性考察 分别制备空白血浆样品、空白血浆+内标溶液（internal standard，IS）、替考拉宁最低定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）（3.12 μg·mL-1）血浆样品+IS、患者血浆样品+IS，按照“2.3”项下方法处理样品，进样分析，记录色谱图（图1）。人血浆中替考拉宁和IS的保留时间分别为8.7 min和11.0 min，并且与前后峰分离度良好，血浆中的内源性杂质对测定无干扰，结果显示本测定方法专属性良好。

图1 替考拉宁色谱图A-空白血浆，B-空白血浆+内标溶液，C-空白血浆+替考拉宁最低定量下限（3.12 μg·mL-1），D-患者血浆样品+内标溶液；1-替考拉宁，2-哌拉西林钠Fig 1 The HPLC chromatogram of teicoplaninA-blank plasma, B-blank plasma + internal standard (IS), C -blank plasma + LLOQ (3.12 μg·mL-1), D-patient plasma sample +IS; 1-teicoplanin, 2-piperacillin sodium

2.4.2 残留效应的考察 最高浓度样品制备：将“2.3”项下50 μL最高浓度标准溶液（100.00 μg·mL-1）加入到500 μL不同来源空白混合血浆中，按照“2.3”项下方法处理样品，按照注射高浓度样品之后注射空白样品来估计残留，空白和最高浓度样本均进行6次样本测定。结果表明，高浓度样品之后在空白样品中的残留不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%，符合指导原则要求。

2.4.3 标准曲线的线性考察 精密吸取“2.2.1”项下替考拉宁标准溶液50 μL，加入空白血浆950 μL配制成浓度为100.00 μg·mL-1的样品A。取空白血浆依次等比例稀释，配制成浓度分别为50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 μg·mL-1的样品B、C、D、E、F。按“2.3”项下方法处理血浆，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各组分的峰面积。以替考拉宁浓度（X）对替考拉宁主峰组分TA2-2面积（Y）作图，采用最小二乘法进行线性回归。结果显示，替考拉宁在3.12～100.00 μg·mL-1的浓度范围内与替考拉宁峰组分TA2-2面积呈良好的线性关系，回归方程为第一天：Y= 0.038X+ 0.013 5，R2= 0.999 2；第二天：Y= 0.040X+ 0.006 6，R2= 0.999 5；第三天：Y=0.039X+ 0.005 56，R2= 0.999 9，标准曲线的各质量浓度值与其理论值的偏差都在±15%以内。

2.4.4 批内、批间精密度与准确度的考察 按“2.2.4”项下方法配制成质量浓度分别为33.33、11.11、3.70、3.12 μg·mL-1的质控样本，按照“2.3”项下方法处理样品，每个浓度取5个样本进行分析，连续测定3 d，按当日的随行标准曲线回归方程计算浓度，并根据质控样本的浓度计算批内和批间精密度和准确度，结果显示，批内和批间RE分别为为- 7.19%～7.00%和- 4.70%～ 3.99%，批内和批间RSD分别为0.76%～8.54%和2.36%～4.48%，表明本方法准确度、精密度良好。相对偏差（RE）=（测量值-理论值）/理论值×100%。准确度和精密度结果见表1、表2。

2.4.5 稳定性考察 血浆样本稳定性考察：将“2.3”项下的低、高浓度质控溶液加入到500 μL混合空白血浆中，分别制备成低、高浓度质控样品（3.70 μg·mL-1、33.33 μg·mL-1）各5份，分别考察不同条件下替考拉宁的稳定性：血浆经过- 20 ℃冰箱到室温的3次冻融后，按照“2.4”项下方法处理样品，得到冻融稳定性样本；将血浆样本按如下条件储存：①放置于- 40 ℃冰箱放置21 d；②4 ℃下放置6 d，再于室温放置24 h，按照“2.4”项下方法处理样品，得到长期稳定性样本。将低、高浓度质控样品（3.70 μg·mL-1、33.33 μg·mL-1）按照“2.4”项下方法处理后，按如下条件储存：①4 ℃下放置24 h；②室温放置24 h，得到进样池稳定性和室温稳定性样本。结果显示，所有测定值的RSD和RE均在15%范围内，表明替考拉宁储备液和工作溶液、血浆样品、以及处理后样品在所示试验条件下稳定。

表1 人血浆中替考拉宁的批内、批间精密度和准确度（内标法）Tab 1 Intra and inter-day precision and accuracy determination of teicoplanin quality controls in human plasma (internal standard method)

表2 人血浆中替考拉宁的批内、批间精密度和准确度（外标法）Tab 2 Intra and inter-day precision and accuracy determination of teicoplanin quality controls in human plasma (external standard method)

2.4.6 临床应用 在2018年11月- 2019年3月期间，共有9例患者均采用静脉滴注方式给予注射用替考拉宁，在给予负荷剂量3～8次，维持剂量2～4次后，于患者下一次给药前抽取静脉血（EDTA抗凝管）。样本3000 r·min-1离心10 min，取血浆400 μL，按“2.3”项下方法处理，根据当日标准曲线定量，测得替考拉宁血药浓度，详见表4。

本实验测定的9例患者谷浓度差异显著，仅有2例（编号1、7）在说明书中建议的有效浓度（10～20 μg·mL-1）范围内，其中有4例（序号5、6、8、9）患者谷浓度低于说明书中建议的有效浓度，3例（序号2、3、4）患者谷浓度大于20 μg·mL-1，高于治疗浓度范围。但是患者的耐受性良好，均未出现不良反应。第1～3号患者，由于其肾功能受损（＜ 60 mL·min-1），替考拉宁经肾脏的清除受到影响，应用常规剂量（6 mg·kg-1）能够满足治疗浓度需求，甚至需要适当减少用药剂量。而对于肾功能正常的患者可能需要增加给药剂量才能达到治疗浓度范围。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

色谱柱选择，分别使用Agilent（C18柱：150 mm×4.6 mm，5 μm）和kromasil（C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm）进行分析，结果显示kromasil色谱柱对替考拉宁的保留较Agilent色谱柱强，分离效果较Agilent色谱柱好，故选用kromasil色谱柱分析。

在流动相的选择上，水-乙腈系统可以获得良好的峰型。水与乙腈的体积比为75∶25时，替考拉宁和内标的保留时间为8.7 min和11.0 min，总分析时间为13 min，且分离度＞ 1.5，满足基线分析需要。向流动相中添加离子对试剂可以进一步改善峰型，实验过程中尝试了不同种类和浓度缓冲盐，如甲酸铵、乙酸铵、磷酸二氢钾。结果发现，水中加入0.01 mol·L-1KH2PO4时峰型最佳，故我们最终选择向水中加入0.01 mol·L-1KH2PO4用于分析。

对于检测波长的选择，分别选择215 nm和240 nm作为检测波长，进行检测，发现波长为215 nm时，血浆中的杂质吸收较强，对替考拉宁的测定有干扰；而波长为240 nm时血浆中的杂质吸收较弱，不影响样品分析，且能够满足最低定量限的检测要求，因此选择240 nm作为检测波长。

替考拉宁主要是由5个结构相似的化合物组成，其中以TA2-2为主。研究[7-8]发现，仅测定TA2-2峰面积与测定TA2-2～TA2-5总峰面积相比无统计学差异，由于仅测定TA2-2峰面积方法定量时较为方便，因此采用TA2-2定量。

表3 替考拉宁的稳定性试验. n = 6Tab 3 Stability data of teicoplanin. n = 6

表4 患者血药浓度测定结果Tab 4 The TDM results of teicoplanin in patients

3.2 内标的选择

本研究分别选择哌拉西林钠、对羟基苯甲酸甲酯、香草醛、苯巴比妥、拉莫三嗪作为内标，结果显示除哌拉西林钠之外的化合物出峰均较早，难以与血浆中的杂质基线分离，故选择哌拉西林钠为内标。但是临床中会存在同时使用哌拉西拉钠和替考拉宁的情况，同样的数据用外标法进行方法学验证（结果见表2），结果表明外标法同样满足方法学要求。因此，对于合并使用哌拉西林及替考拉宁的情况，可以使用外标法进行数据处理。

3.3 样品前处理方法的选择

替考拉宁的极性较大，在样品处理方法上，本实验先采用乙腈蛋白沉淀法后再采用不同有机溶剂液液萃取的方法，包括二氯甲烷、甲基叔丁基醚等，结果表明乙腈沉淀蛋白后，用二氯甲烷萃取样品的分离度较甲基叔丁基醚好。因此本实验选择二氯甲烷作为液液萃取溶剂进行样品处理。

3.4 TDM的临床应用

有文献[4,13]报道替考拉宁血清谷浓度（Cmin） ＜ 10 μg·mL-1为未达到满意的治疗浓度， 10 μg·mL-1≤Cmin＜ 20 μg·mL-1为治疗革兰阳性菌感染（MRSA）的有效浓度，20 μg·mL-1≤ Cmin＜ 60 μg·mL-1为治疗心内膜炎、血流感染、肺炎等严重金葡菌感染的有效浓度，≥ 60 μg·mL-1为产生毒性的血药浓度。

本文中测定的9例患者（其中病例1是血滤患者，病例2和病例6的BMI ＞ 30 kg·m-2,使用校正公式进行肌酐清除率计算）使用替考拉宁在4.40～8.70 mg·kg-1剂量范围内，但是血药浓度差异较大。替考拉宁的半衰期较长，需要给予负荷剂量以快速到达稳态血药浓度，但是关于负荷剂量尚未定论。有研究[5,13-14]表明，负荷剂量过小难以达到有效的浓度范围，而剂量过大又会带来不良反应，因此我们应密切关注患者替考拉宁的血药浓度，通过监测其谷浓度及时调整用药方案以实现患者的个体化给药，既保证替考拉宁的临床疗效减少耐药的产生，又减少不良反应的发生率。

综上，本研究所建立的方法分析浓度范围为3.12 ～100.00 μg·mL-1且方法专属性强、灵敏度高、重现性好、分析时间短，能够满足临床需求。在临床工作中，为达到最佳治疗效果，避免药品不良反应的发生，应监测患者替考拉宁的血药浓度，并及时调整用药方案。