肝泡型包虫病侵及胆道患者胆汁外泌体microRNA的检测及生物信息学分析

王志鑫，苟 平，于文昊, 任 利，阳丹才让，王海久，樊海宁

1 青海大学附属医院 肝胆胰外科 西宁 810000； 2 青海省包虫病重点实验室，西宁 810000；3 成都京东方医院 普通外科，成都 610000

泡型包虫病为多房棘球蚴感染致病，它以浸润方式增殖，类似肿瘤，可不断产生新囊泡，直接侵犯邻近的组织结构(如肝脏Glisson鞘)。临床上常可观察到肝泡型包虫病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)患者出现黄疸进行性加重、反复感染以及各肝门部重要管道结构受侵等表现。这类患者预后较差，肝移植成为了最后选择[1]。胆汁作为一种非循环体液，蕴含丰富的胆道疾病信息，且局部囊泡的浓度高，几乎不受远隔器官病变的影响[2-3]。本研究以HAE侵及胆道患者胆汁中外泌体为对象，进行microRNA(miRNA)表达谱芯片实验及生物信息学分析，探索HAE侵及胆道的相关机制，为改善此类患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集自2017年8月-2018年10月就诊于青海大学附属医院，经包虫IgG抗体试验、腹部CT/MRI检查诊断为HAE的12例患者胆汁样本。观察组(A组，n=6)：有胆道受侵表现[4-5][有阻塞性黄疸；CT/磁共振胰胆管造影(MRCP)提示肝内包虫占位病灶邻近主要胆道分支且二者关系密切，相应区段肝内胆管明显扩张]，为经皮经肝胆管引流术(percutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD)穿刺后第1天收集；对照组(B组，n=6)：无胆道受侵表现(无阻塞性黄疸；CT/MRCP提示肝内包虫占位病灶邻近区段胆管无扩张)，为全麻手术入腹后穿刺胆囊收集。

1.2 研究方法

1.2.1 胆汁样本收集与保存 经全麻术中或PTCD穿刺后第1天收集胆汁样本。收集后经4000×g离心15 min后，吸取上层澄清部分置于-80 ℃冰箱冻存。过程中严格无菌操作，冻存后避免样本反复冻融，且保证只在提取外泌体时才被解冻。

1.2.2 胆汁样本中外泌体RNA提取及质检 将上述胆汁样本送至上海吉凯基因化学技术有限公司，使用超速离心机(美国Thermo公司)提取并经Western Blot鉴定胆汁样本中外泌体结构后，用Trizol试剂(美国Thermo公司)提取各样本外泌体总RNA，经Nanodrop 2000(超微量紫外分光光度计，美国Thermo公司)测定各样本总RNA浓度，对满足芯片实验上样需要(130～1000 ng)的样本进行miRNA表达谱芯片实验。

1.2.3 miRNA表达谱芯片实验 使用RNA Labeing Kit及GeneChip miRNA 4.0(美国Affymetrix公司)分析获得miRNA表达谱。以|Fold Change|>2作为显著性差异标准，筛选差异miRNA。

1.2.4 差异miRNA的生物学信息分析 两组比较，若差异miRNA表达上调，定义差异表达倍数Fold Change=观察组/对照组；若表达下调，则定义Fold Change=-对照组/观察组。以|Fold Change|>2作为显著性差异的筛选标准。选择差异倍数最大的10个miRNAs，在Targetscan、miRNA.ORG和miRDB三个数据库中进行靶基因预测，选取Count数(即该基因在数据库中被预测到的频次)为3的基因作为该miRNA的靶基因，以提高可信度。以错误发现率(false discovery rate，FDR，即P值经Fisher精确检验后，再经Benjamini-Hochberg校正所得)<0.05为显著性指标，进行Pathway分析及GO注释富集分析。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由青海大学附属医院伦理委员会审批(批号：P-SL-2019072)。

2 结果

2.1 外泌体标志性蛋白检测 提取胆汁中外泌体后，经Western Blot检测外泌体标志性蛋白(CD63、CD9、TSG101)。结果显示，两组样本中均检测到不同表达程度的标志性蛋白，证实各胆汁样本中外泌体客观存在(图1)。

2.2 芯片数据的质量评估

2.2.1 信号强度分布统计 图2显示各样本芯片探针的信号强度重合度好，芯片实验可靠性高。

2.2.2 相对对数信号强度统计 图3显示各样本相对对数信号强度箱线图的分布相近，数据的重复性好，芯片数据质量较好。

2.3 miRNA的显著性差异分析 经miRNA表达谱芯片实验后，以|Fold Change|>2作为显著性差异标准，筛选表达差异miRNA。结果显示，A组与B组比较，共有74个显著差异表达的miRNAs，其中9个表达上调，65个表达下调(表1)。

2.4 显著性差异miRNA的生物信息分析

2.4.1 靶基因预测 选择差异倍数最大的10个miRNAs，进行靶基因预测。选取Count数量为3的基因作为该miRNA的靶基因。结果共预测到45个靶基因，包括AFF3、STK4、PIK3R1、PTEN等(表2)。

2.4.2 相关信号通路分析 通过基于KEGG & BioCarta的通路注释及富集分析发现，A组相较于B组，靶基因主要在肿瘤发生(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇信号系统(phosphatidylinositol signaling system)、PTEN、AKT等通路中显著富集表达，预示HAE侵及胆道后，显著影响了这些通路的信号转导过程(图4)。

2.4.3 GO注释 经GO注释发现，A组相较于B组，靶基因主要在GO-BP方面富集表达，预示着HAE侵及胆道后，显著影响了包括基因抑制的正向调控(positive regulation of gene repression)、调控细胞分化(regulation of cell differentiation)等在内的生物过程(图5)。

表1 74个显著差异miRNAs及表达情况

表2 靶基因预测结果

3 讨论

外泌体是具代表性的一类囊泡结构，它是由多种细胞在生理或病理状态下分泌的一种微小囊泡，含大量与其来源和功能密切相关的蛋白质、脂质、核酸等物质[6]。miRNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，是转录后机制的重要调节因素，它主要通过参与基因的转录后调控实现对靶基因的表达调控，从而影响各种生命活动进程[7]。在宿主-寄生虫相互作用过程中，外泌体miRNA起着重要的调节作用。宿主被蠕虫感染后，相关宿主细胞或组织中miRNA失去了调节功能，预示miRNA这种功能变化导致了寄生虫感染、致病宿主的病理过程[8]。寄生性绦虫分泌的细胞外囊泡包含有miRNA及免疫诊断性蛋白等物质成分[9]。miRNA不同于基因或蛋白，它具有时空性或阶段性特点，即在同一疾病不同状态下其表达量存在差异。本研究以差异倍数|Fold Change|>2作为筛选差异miRNA的主要指标。经miRNA表达谱芯片分析得出差异显著的10个miRNAs分子，可作为诊断HAE侵及胆道的生物学标志物。因此可以预测，当包虫病灶侵犯胆道后，人体分泌、释放的外泌体及外泌体中的包裹物(如miRNA)也随之受到影响。通过分析HAE侵犯胆道后胆汁中外泌体miRNA的表达特征，筛选出差异显著的miRNA作为胆道受侵生物标记物，可为后期临床应用微流控等床旁检测仪分析胆道穿刺液或引流液中外泌体特异性miRNA奠定实验基础。在分析胆汁外泌体差异miRNA的基础上，可结合胆道造影、CT、MRCP等进行术前规划、风险评估。若上述依据支持包虫病灶累及主要胆道，则需考虑术中对侵犯部位胆道进行完整切除及重建可能，或者在面临包虫病灶不可切除的情形下(如合并重要血管的侵犯)，为选择姑息手术抑或等待肝移植等治疗方案时提供临床抉择，因此具有临床指导意义。

Masyuk等[10]研究表明，胆汁中外泌体与胆管细胞纤毛相互作用时，会影响ERK1/2(细胞外信号调节激酶)信号通路而使miRNA-15a表达增加，进而导致胆管细胞增殖减少。这反应出胆汁中外泌体miRNA通过调控信号通路活动水平而影响某些生理或病理过程。本研究对上述差异显著的10个miRNAs分子进行靶基因预测，共预测到45个靶基因。经基于KEGG & BioCarta的通路富集分析[11]显示，上述靶基因在肿瘤发生、磷脂酰肌醇信号系统、黑色素瘤、PTEN等通路中富集程度较高，预示HAE侵及胆道后显著影响了上述通路的信号转导或代谢过程。经GO注释[12]及富集分析显示，靶基因主要在GO-BP方面富集表达，预示HAE侵及胆道后显著影响了包括基因抑制的正向调控、调控细胞分化、生殖系统发生发展等在内的生物过程。

本研究的不足在于实验样本量较少，未进行qPCR验证差异miRNA及靶基因。实际情况归因于胆汁样本的取材较困难，只能经PTCD或在包虫病灶联合胆囊切除术中穿刺胆囊的途径获得，可在取材过程中无菌操作。尚有部分晚期HAE患者放弃临床治疗，不能经上述途径收集胆汁样本，造成了部分符合入组标准的病例流失。后期需继续收集符合筛选标准的胆汁样本，并经qPCR扩增、验证差异的miRNA。