外泌体在胰腺癌转移中的作用

李 瑞，张海蓉，张景丽，张宇艳，李若畅

昆明医科大学第一附属医院 消化内科，昆明 650032

胰腺癌是发生于胰腺外分泌腺的恶性肿瘤，胰腺导管腺癌是胰腺癌的主要类型，占80%～90%，其致死率居世界恶性肿瘤中第七位[1]。胰腺癌起病隐匿，早期症状不典型，易出现转移，然而现有的影像学检查及血清学标志物难以发现其微小的转移，80%以上的患者确诊为胰腺癌时已出现明显的远处转移，丧失了根治性手术的机会，5年的生存率仅有9%[2-4]。鉴于转移是影响胰腺癌患者预后的主要原因，明确胰腺癌转移的潜在机制，探索有效的治疗方法是胰腺癌治疗中亟待解决的问题。外泌体是由多种细胞分泌至细胞外的囊泡结构，研究发现外泌体与胰腺癌的侵袭转移密切相关。本文就外泌体在胰腺癌的侵袭转移方面进行综述。

1 外泌体概述

几乎所有的哺乳动物细胞无论在生理或病理过程中均会释放细胞外囊泡，细胞外囊泡又分为胞外体和外泌体；胞外体是通过向细胞外萌芽并截取质膜表面而形成的囊泡，包括微囊泡、微粒子和直径为50～1000 nm的大囊泡；外泌体是一种直径大小为40～160 nm(平均100 nm)的细胞外囊泡。外泌体来源于质膜的连续内陷最终导致多囊小泡的形成，这些多囊小泡与细胞内的其他囊泡和细胞器相互作用，从而增加了外泌体成分的多样性；成熟的细胞内多囊小泡与细胞膜融合后释放到细胞外基质[5]。外泌体中主要包含蛋白质、脂质、核酸(非编码RNA、mRNA和DNA)和代谢产物等生物大分子，并分布于血浆、尿液、唾液和乳汁等各种体液中[6]。目前可通过超速离心、超滤、尺寸排除色谱、聚合物沉淀法、免疫亲和层析法和基于微流体的技术等方式对外泌体进行分离提纯[7]。通常根据外泌体的大小和来源来选择分离提纯方法，但这些方法普遍存在提取效率低、价格昂贵、特异性较低等不足。

外泌体最早是1983年Pan和Johnstone[8]在绵羊网织红细胞的体外实验中发现。最初外泌体被认为是细胞的代谢废物而未引起重视。近年来，随着对外泌体的深入研究发现，外泌体在其表面表达特定的黏附分子、整合素和四跨膜蛋白，通过与跨膜受体和配体的相互作用来调节靶细胞对外泌体的吸收；然后以膜融合的方式将蛋白和核酸等物质转运到受体细胞中以调控蛋白质表达和多种信号通路，从而在维持生理状态和疾病进展等方面发挥生物学作用[9]。其生物学功能包括参与机体的免疫应答、抗原递呈、肿瘤的侵袭转移等[10]。

2 外泌体与胰腺癌的转移

胰腺癌的转移是肿瘤细胞侵袭性增强，通过血管浸润离开原发部位，经循环系统扩散至全身各部位，然后在转移部位定植的复杂多步骤过程。近年来研究发现外泌体在胰腺癌的转移过程中发挥着重要作用；胰腺癌来源的外泌体通过作用于邻近组织诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、促进血管生成，在远隔器官处参与形成转移前微环境以及抑制机体免疫等方式参与胰腺癌的侵袭及转移。

2.1 外泌体与胰腺癌肿瘤微环境

肿瘤微环境是指肿瘤细胞所在的内外环境，由内皮细胞、免疫细胞和肿瘤相关成纤维细胞，以及分泌到组织间隙的细胞外基质和其他细胞因子组成的一个复杂异质性环境，与肿瘤的发生发展及转移过程密切相关[11]。外泌体是肿瘤细胞与肿瘤微环境之间信号传导的重要媒介。胰腺癌来源的外泌体通过作用于肿瘤微环境，诱导EMT，促进血管生成来介导胰腺癌的侵袭及转移。

2.1.1 外泌体诱导EMT EMT是指在正常的生理或病理条件下上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，EMT不仅在胚胎发育和组织重建发挥了重要作用，而且是肿瘤浸润和转移的重要开端[12]。在EMT下，肿瘤细胞失去极性和细胞之间的紧密连接性降低，进入低增殖状态，迁移侵袭、抗凋亡能力增强以及细胞外基质生成增多[13]。EMT的分子标志物是作为上皮标志物的E-钙黏蛋白、细胞角蛋白缺失，作为间质标志物的波形蛋白和纤连蛋白表达增加[14]。肿瘤细胞具有上皮特征时有较强的增殖力，而间质特征易转移。当肿瘤细胞经历EMT后，转移至远隔器官又会向上皮形态逆转(称为间充质向上皮转变)，然后肿瘤细胞将开始在转移部位定植和增殖[15]。Li等[16]发现，具有高度侵袭性胰腺导管腺癌来源的外泌体lncRNA Sox2ot通过充当竞争性内源RNA诱导 EMT和干细胞样特性，促进胰腺导管腺癌的侵袭和转移；lncRNA Sox2ot过度表达，与胰腺导管腺癌患者的肿瘤淋巴结转移分期和总生存率相关。Tang等[17]研究发现，胰腺癌患者与健康对照组之间血清纯化外泌体蛋白质水平有显著的差异，通过用胰腺癌患者的血清纯化外泌体处理胰腺癌细胞(MiaPaCa-2和AsPC-1)，发现胰腺癌细胞中钙黏蛋白表达显著降低，波形蛋白表达显著增加，证实了胰腺癌患者血清来源的外泌体能够促进EMT。最近一项研究[18]发现，低氧情况下胰腺癌衍生的外泌体能够激活PTEN/PI3Kγ信号通路，其次是通过依赖低氧诱导因子HIF1a或HIF2a的方式激活巨噬细胞转化为M2表型，进而促进胰腺癌细胞EMT。综上所述,外泌体通过诱导EMT增强胰腺癌细胞的侵袭性及转移能力，是转移形成的第一步，也是最重要的步骤；因此，靶向原发部位外泌体促进肿瘤细胞EMT或许是抗胰腺癌转移治疗的关键，但外泌体诱导EMT潜在的机制尚未完全阐明，仍需更多的研究来证实。

2.1.2 外泌体与血管生成和血管通透性 一方面血管的生成为肿瘤细胞的快速繁殖提供了重要的营养物质，并且是肿瘤细胞血行转移的重要通道，是肿瘤生长和转移的必要条件[19]。肿瘤细胞衍生的外泌体在促进血管生成中起着重要作用[20]。生理条件下的内皮细胞产生的外泌体能够维持内皮细胞的稳态，但肿瘤细胞来源的外泌体会打破内皮细胞的稳态，病理性的促进血管生成[21]。另一方面增加血管的通透性也促进了肿瘤的浸润及转移。胰腺癌细胞产生的外泌体中的核酸物质、蛋白质等生物活性分子释放到肿瘤微环境中，通过作用于血管内皮细胞促进血管生成和改变血管通透性来促进胰腺癌的侵袭和转移。内皮细胞是一种位于各类器官微毛细血管床上的异质性细胞团，其中人微血管内皮细胞就是其中之一[22]。Shang等[23]研究发现，胰腺癌细胞衍生的外泌体中携带有miRNA-27a作用于血管内皮细胞，通过抑制靶基因BTG2的表达并上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)的水平，从而促进胰腺癌中血管的生成。 Chiba等[24]研究中，胰腺癌细胞释放的外泌体可以促进体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖；进一步研究发现，胰腺癌PK-45H细胞释放的外泌体通过依赖HUVEC中的动力蛋白内吞作用激活内皮细胞中的AKT和ERK1/2激酶信号传导通路，进而促进血管形成。另外有研究[25]发现，AsPC-1系胰腺癌细胞分泌的外泌体且富含花生四烯酸，能够刺激巨噬细胞分泌PGE2和VEGF等，通过作用于血管内皮细胞从而促进血管生成。四跨膜蛋白Tspan8是在大鼠胰腺导管腺癌衍生的外泌体中发现的，表达Tspan8的外泌体与CD49d结合内皮细胞，诱导非VEGF依赖调控的几种血管生成相关基因、趋化因子和受体的表达，促进内皮祖细胞增殖，迁移和成熟[26]。肌铁蛋白是一种230 kD跨膜C2结构域蛋白，属于Ferlin蛋白家族，在胰腺癌外泌体中过度表达，具有调控VEGF生成的作用，并参与肿瘤生长和肿瘤血管形成；经敲除肌铁蛋白基因处理的胰腺导管腺癌产生的外泌体诱导HUVEC迁移和增殖能力明显降低，从而抑制血管生成[27]。另外有研究[28]发现，外泌体中Circ-IARS在胰腺癌组织中高表达，Circ-IARS通过外泌体整合到脐静脉内皮细胞，下调miRNA-122以及上调Ras同源基因家族成员A(RhoA) 和RhoA-GTP水平，促进细胞骨架肌动蛋白重构和内皮细胞收缩，并减少紧密连接蛋白ZO-1的表达，从而破坏了内皮细胞的屏障功能，导致血管的通透性增加，有利于肿瘤细胞穿透血管壁发生远处转移。综上所述，胰腺癌来源的外泌体作用于血管对胰腺癌的生长和转移具有重要的意义；目前关于外泌体对内皮细胞作用大多研究集中在促进血管生成作用上，在改变血管通透性方面的研究较少，还需更多的研究来进一步证实，从而为胰腺癌转移的抗血管治疗提供坚实的理论依据。

2.2 外泌体参与转移前微环境的形成 转移前微环境是在肿瘤细胞到达未来转移部位之前出现的适合转移瘤存活和生长的微环境，肿瘤来源的外泌体调节远处转移微环境中的间充质细胞，以促进肿瘤细胞的远处定植和增殖[29]。外泌体可以介导邻近或远隔细胞间的信号传导，其包含有调节转移前微环境的关键因子。Hoshino等[30]研究发现，来源于胰腺癌的外泌体过度表达特异性整合素αvβ5具有一定的靶向性，可以选择性地黏附于肝脏内细胞外基质丰富的区域，进而激活Src磷酸化和促炎S100基因的表达，触发炎症反应和免疫抑制性细胞的招募，以促进转移前微环境形成。在小鼠胰腺癌模型中,胰腺导管腺癌衍生的外泌体能够诱导肝脏转移前的微环境形成，外泌体中巨噬细胞迁移抑制因子能够诱导肝脏Kupffer细胞释放转化生长因子，进而促进肝星状细胞产生纤连蛋白，纤连蛋白沉积有助于骨髓来源的巨噬细胞和中性粒细胞在肝脏中的募集，从而完成了转移前微环境的形成[29]。Rana等[31]研究发现，转移性大鼠胰腺癌BSp73ASML的外泌体中miRNA能下调钙黏蛋白17，促进蛋白酶、黏附分子和其他相关蛋白质的表达，从而促进转移前微环境的形成，为肿瘤细胞转移至肺部或淋巴结做准备。综上所述，外泌体在胰腺癌形成转移前微环境中起重要作用；因此，可以针对外泌体在转移微环境形成的机制来寻找治疗靶点。

2.3 外泌体与免疫抑制微环境 当胰腺癌细胞转移至远隔器官后, 需要逃避机体的免疫监视,并抑制机体对转移瘤的免疫清除，才能存活下来。胰腺癌来源的外泌体传递免疫抑制信号分子能够促进免疫抑制性细胞的分化和募集，并靶向调节免疫细胞的发育、成熟、活化以及抗肿瘤能力，从而建立免疫抑制微环境来维持肿瘤细胞的增殖。骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一类具有抑制自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞的免疫作用以及促进调节性T淋巴细胞形成等功能的未成熟骨髓细胞[32]。胰腺导管腺癌衍生的外泌体中蛋白质和miRNA-1260a及miRNA-494-3p通过依赖smad4的方式来影响骨髓细胞中的钙流量和糖酵解，从而诱导MDSC的形成[33]。Chalmin等[34]在原位胰腺癌小鼠模型注射胰腺导管腺癌Panc02-H7细胞来源的外泌体，发现肝脏MDSC浸润增加，同时外泌体也触发了MDSC中信号传导和活化转录因子3的激活，随之激活了MDSC的免疫抑制功能，这有助于建立免疫抑制微环境。胰腺癌外泌体中的miRNA-203能够下调树突细胞(DC)中的Toll样受体4和细胞因子TNFα和IL-12等，从而削弱DC的免疫功能，而敲除miRNA-203的外泌体可逆转这一现象[35]。另一项研究[36]发现，胰腺导管腺癌衍生的外泌体通过miRNA-212-3p抑制调节因子X相关蛋白表达，使DC无法激活CD4+T淋巴细胞，以降低MHC Ⅱ表达并诱导DC的免疫耐受，这有助于在胰腺导管腺癌微环境中产生免疫耐受。Zech等[37]的研究发现，大鼠导管腺癌衍生的外泌体作用于DC和巨噬细胞会干扰IL-2活化淋巴细胞，并通过抑制AKT/PI3K信号通路诱导淋巴细胞凋亡。此外，低氧诱导的外泌体miRNA-301a-3p激活PTEN/PI3Kγ信号通路，使巨噬细胞极化到原瘤M2表型，并抑制T淋巴细胞分泌细胞因子；极化的M2巨噬细胞还会促进与胰腺癌免疫抑制巨噬细胞表型相关基因的转录，从而促进胰腺癌的侵袭及转移[18]。Que等[38]通过裂解和超滤的方式去除外泌体中miRNA，同时保留补体多肽等蛋白质成分，缺失miRNA的外泌体可促进DC的增殖及TNFα的产生和穿孔素的分泌，从而增强对体外胰腺癌细胞的杀伤作用，表明外泌体有可能成为胰腺癌的免疫治疗的潜在靶点。综上所述，外泌体通过介导免疫调节，参与免疫抑制微环境的形成，促进胰腺癌的侵袭和转移。因此，阻断外泌体介导的免疫抑制性肿瘤微环境的形成对胰腺癌的治疗有重要意义。

3 总结

外泌体介导细胞间信号传导，与胰腺癌的转移密切相关；首先外泌体在胰腺癌肿瘤微环境中诱导EMT使肿瘤细胞获得高侵袭性和促进血管生成有助于肿瘤细胞经血管进入体循环，外泌体还能定位肿瘤细胞将要转移的器官，然后参与形成利于转移瘤生长的转移前微环境，并通过生物活性分子抑制机体免疫进而影响胰腺癌转移。外泌体参与胰腺癌转移的过程为理解胰腺癌的转移背景提供了新的见解；因此，阻断或抑制外泌体的生成有望成为胰腺癌治疗的潜在靶点。目前关于外泌体在胰腺癌转移调控中的作用研究正处于初始阶段，大部分研究主要集中在动物模型上及体外实验，对其潜在机制还需更多的临床研究来阐明。此外，由于外泌体体积较小，种类繁多，对其分析非常困难，目前尚无经济、简便、标准的外泌体的分离提取技术，限制了外泌体的研究，外泌体应用于临床实践还有很长的路要走。但随着外泌体分离提取技术和基因测序的快速发展及人们对外泌体的深入研究，未来将会发现针对胰腺转移的有效治疗措施，从而改善胰腺癌患者的预后。