饲料中添加还原型谷胱甘肽对中华鳖生长性能、血清生化指标及肝脏超氧化物歧化酶基因表达的影响

陆 星，吴 凡，文 华，刘 伟，田 娟，蒋 明，喻丽娟，梁宏伟

(中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)

中华鳖(Pelodiscussinensis)，俗称甲鱼，隶属脊椎动物亚门爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，是我国重要的特种水产养殖品种之一[1]。据2019年中国渔业年鉴报道，全国鳖的养殖产量达到31万t以上。目前，中华鳖的养殖已逐渐从小规模的土池养殖进入到集约的温室养殖[2]。但集约化养殖过程中会出现大量的应激因子，如拥挤、环境恶化(包括温度、氨氮、溶氧、亚硝酸盐)等导致机体代谢异常，引起氧化应激和免疫功能下降，从而造成其氧化损伤、生长速度降低甚至引发病害。因此，运用营养调控手段，在饲料中添加抗氧化物质提高中华鳖的生长性能和抗氧化应激能力，将对中华鳖的健康养殖产生积极作用。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸与甘氨酸结合而成的三肽活性物质。作为真核细胞中重要的生物活性物质，GSH在清除机体内的自由基时起关键作用[3]。对畜禽的研究表明，饲料中添加适量的GSH可提高仔猪[4]和肉鸡[5]的生长性能和抗氧化能力。在水产养殖上，对GSH的研究主要集中于淡水和海水养殖鱼类。例如，赵红霞等[6]报道，饲料中添加GSH可以提高草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血清中胰岛素生长因子IGF-1的水平，并增强其非特异性免疫功能。罗非鱼(Oreochromisniloticus)饲料中添加一定量的GSH能够显著提高其总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力[7]。王芳倩等[8]研究发现，饲料中添加适量的GSH能够增强牙鲆(Paralichthysolivaceus)的生长和抗氧化能力。然而，关于GSH应用在爬行类的研究报道还较少。因此，本实验以中华鳖为研究对象，探讨饲料中添加GSH对中华鳖生长性能、血清生化指标及肝脏超氧化物歧化酶基因表达的影响，以便为GSH在中华鳖饲料中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

以白鱼粉、啤酒酵母和大豆浓缩蛋白为蛋白源，豆油为脂肪源的基础饲料，在其中分别添加0、100、200和400 mg/kg的GSH，并依次设置为G0(对照)、G100、G200和G400共4个试验组。还原型GSH购自西安皓源生物技术有限公司，饲料中GSH的实测值分别为：0、96.57、184.11和367.93 mg/kg。各组饲料配方及营养成分见表1。

表1 各组饲料配方及其基本营养组成(干重)

1.2 试验鱼和饲养管理

养殖试验在安徽喜佳农业发展有限公司中华鳖养殖场的温室进行。试验前将雄性日本品系中华鳖驯养2周。结束后，选择大小均匀、健康无病的雄性日本品系中华鳖(均重389.18 g±5.98 g)36只。试验鳖随机分成4组，每组9只(3个平行，每个平行3只)，饲养于12个长方形塑料箱(90 cm×60 cm×35 cm)中，箱中水深约25 cm，每个养殖箱中挂3块网片，供中华鳖攀爬栖息，箱中设置一块20 cm×30 cm的食台，食台设在水下2～3 cm。每天投喂6～8 mm左右的颗粒饲料，分三次投喂(8:30、13:30和18:30)，并留样用于基础饲料营养成分分析。投喂量按其体重的1%，以20 min之内吃完为宜。若观察到有未食完饵料,收集烘干称重并记录。每晚20:00用吸管清除养殖箱中粪便，并补充新水，每3 d换水一次。养殖实验持续8周，饲养期间水温控制在(32±1)℃。

1.3 样品采集与分析

1.3.1 样品采集

养殖试验结束后，禁食24 h，称重并计算其增重率、饲料效率和肝体比。将中华鳖从颈动脉处取血，制备血清；分离其背甲与腹甲，解剖取出肝脏并称重，用于计算肝体比，另取约0.2 g左右的肝组织放入液氮冷冻保存，用于基因表达分析。取四肢肌肉样品，并储存于-20 ℃冰柜，用于常规营养成分的测定。

1.3.2 生长指标计算

增重率(WGR)=100%×(Wt-W0)/W0

饲料效率(FE)=增重量/投饲量

肝体比(HSI)=100%×(肝脏重/体质量)

式中：Wt为试验结束时鳖的体质量；W0为初始体质量

1.3.3 常规营养成分测定

水分含量检测采用直接干燥法(GB/T 5009.3-2003)；粗蛋白含量检测采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)；粗脂肪含量检测采用索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)；灰分含量测定采用灼烧称重法(GB/T 5009.4-2003)(中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会，食品卫生检测方法理化部分)。

1.3.4 血清生化指标检测

血清总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)含量、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性采用日本希森美康全自动生化分析仪(Sysmex,CHEMIX-800)测定，所用试剂均购自Sysmex公司。

1.4 RNA提取、反转录和荧光定量 PCR(qPCR)

采用TRIZOL方法(Invitrogen，美国)提取各组中华鳖肝脏组织的总RNA，并用RNase-free DNase I(Takara)去除残余的DNA，取1 μL RNA样品快速高压电泳以检测RNA完整性，用紫外分光光度计(Biophotometer Eppendorf)对RNA浓度进行测定，按照Fermentas RevertAidTM First试剂盒的操作说明书进行cDNA第一链的合成。

使用Applied Biosystems 7500实时定量PCR检测系统进行qPCR分析，荧光定量试剂SYBR Green Real Master Mix购自天根生化科技有限公司。根据GenBank序列设计超氧化物歧化酶1(sod1)和超氧化物歧化酶2(sod2)基因的引物(采用Primer Premier 6.0软件设计)，同时选用中华鳖β-actin基因作为内参，引物序列见表2。PCR反应体系：2×SYBR Green Real Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各0.4 μL，10倍稀释的第一链cDNA样品5 μL，超纯水补足至20 μL。PCR反应条件：95 ℃，5 min；(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s)，40个循环；然后每个循环增加1 ℃，从65 ℃升高到95 ℃进行溶解曲线分析，各组反应都重复3次。采用2-△△Ct方法计算各基因表达的变化倍数[9]。

表2 荧光定量PCR所用的引物序列

1.5 统计分析

实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件中one-way ANOVA方差分析和Duncan氏均值多重比较对试验数据进行分析，P<0.05时认为有显著性差异。

2 结果

2.1 饲料中添加GSH对中华鳖生长性能的影响

养殖试验结束后，各组的中华鳖存活率均为100%。由表3可知，添加GSH各组中华鳖的WGR和FE均高于G0组，且在G200组达到最大值(P<0.05)。而各组的HSI无显著性差异(P>0.05)。

表3 饲料GSH水平对中华鳖生长性能和饲料利用的影响

2.2 饲料中添加GSH对中华鳖肌肉营养成分的影响

由表4可知，GSH添加组的粗蛋白和粗脂肪含量均高于G0组，其中G200和G400组的粗蛋白含量显著高于G0组，G200组的粗脂肪含量显著高于G0组。而饲料GSH水平对中华鳖肌肉水分和灰分含量无显著影响。

表4 饲料GSH水平对中华鳖肌肉营养成分的影响

2.3 饲料中添加GSH对中华鳖血清生化指标的影响

由表5可知，饲料中添加谷胱甘肽对中华鳖TCHO、TG、GLU、TP和ALT活性均无显著影响。而与G0组相比，G400组血清AST的活性则显著上升。

表5 饲料GSH水平对中华鳖血清生化指标的影响

2.4 饲料中添加GSH对中华鳖肝脏超氧化物歧化酶基因表达的影响

如图1所示，GSH添加组的肝脏sod1基因相对表达量均高于G0组，其中G200组的相对表达量最高，显著高于G0组；sod2基因相对表达量随着GSH添加量的增加呈不断升高的趋势，在G400组出现最高值，相比G0组上升1.32倍。

图1 GSH对中华鳖肝脏sod1和sod2基因表达量的影响

3 讨论

3.1 GSH对中华鳖生长性能的影响

本研究中添加适量的GSH能显著提高中华鳖的WGR和FE，表明GSH可以改善中华鳖的生长性能。该结果与GSH在牙鲆[8]、草鱼[10]、罗非鱼[11]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[12]、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[13]、鲈(Dicentrarchuslabrax)[14]及凡纳滨对虾(Litopenaeusvanname)[15]等水产动物中的研究结果相似。另外，部分研究报道了饲料中添加GSH对花鲈(Lateolabraxjaponicus)[16]、皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)[17]和斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[18]的生长无显著影响，分析可能与GSH在不同动物的作用途径有关。

本实验结果显示，G200组和G400组肌肉粗蛋白、G200组肌肉粗脂肪含量显著高于G0组。这说明饲料中添加一定量的GSH可显著影响中华鳖的粗蛋白和粗脂肪含量。这一结果与其在草鱼[10]、罗非鱼[11]和黄颡鱼[12]上的结果相似，但在花鲈[16]和奥尼罗非鱼[19]上没有显著性差异。这可能与GSH对不同鱼种蛋白质和脂肪代谢的作用方式不同有关。

3.2 GSH对中华鳖血清生化指标的影响

血清胆固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)是重要的脂类物质,它们含量的高低在一定程度上反映了机体内的脂类吸收和肝脏脂肪代谢状况[19]。在本实验中，添加GSH的各组血清TCHO和TG均高于G0组，这与在草鱼[10]、罗非鱼[11]和黄颡鱼[12]上的研究结果一致。其原因可能是GSH 促进了中华鳖体内生长激素GH的分泌，从而增强了其脂肪代谢，导致血清TCHO和TG含量的升高。血糖(GLU)来源于肝糖原分解和肠道吸收，是机体主要的供能物质。血清总蛋白(TP)含量可反映机体蛋白质代谢和营养状态，同时也与免疫相关联。研究表明，血清TP的含量主要受饲料蛋白源质量的影响，进而显著影响机体的蛋白质代谢[20]。本实验中，添加GSH的各组GLU和TP含量与G0组无显著差异，这与在草鱼[10]、罗非鱼[11]和黄颡鱼[12]上的研究结果相同。其原因可能与各组饲料原料和营养水平一致有关。

谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)主要存在于肝细胞内，是机体内转氨基作用过程中非常重要的酶，临床上常以血清中转氨酶活性来衡量肝脏是否受损[21]。本实验中，添加GSH的各组血清AST活性均高于G0组，且在G400组达到显著水平(P<0.05)。而饲料中添加GSH对ALT的活性无显著影响，但G200和G400组的活性高于G0组。这些结果表明高剂量的GSH可能会影响对中华鳖肝脏的正常生理功能，但同时有助于转氨基作用，进而增强机体合成非必需氨基酸的能力。

3.3 GSH对中华鳖肝脏超氧化物歧化酶基因表达的影响

超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于动植物中，根据分布的不同主要分为SOD1(Cu/Zn SOD，主要分布于胞浆)和SOD2(Mn/Fe SOD，主要分布于线粒体)。SOD是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧化物发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而降低或清除细胞内氧自由基含量。因此，其活性的高低可在一定程度上反映机体内氧自由基的代谢情况及抗氧化能力[22-23]。在正常情况下，sod基因的启动子处于未开放状态，当机体受到刺激或逆境胁迫时，相关转录因子可与sod基因启动子的顺式作用元件结合，激活sod基因发生转录，进而表现在翻译水平上，使SOD的活性上升[24]。周婷婷等[25]研究表明，饲料中添加一定量的GSH能提高吉富罗非鱼sodmRNA的表达量。对凡纳滨对虾的研究也有相似结果，刘晓华等[26]表明饲料中添加适量的GSH可诱导其肝胰腺细胞sod基因的转录表达，进而使肝胰腺细胞的SOD活性上升。本研究的结果显示，GSH添加组的中华鳖肝脏sodmRNA表达量均高于G0组，其中G200组sod1 mRNA的表达量最高，而G400组sod2的表达量最高。这些结果表明，具有抗氧化功能的GSH可诱导中华鳖肝脏sod基因的表达，从而抑制活性氧自由基介导的脂质过氧化反应[27]。

综上所述，饲料中添加一定量的GSH能改善中华鳖的生长性能，提高肌肉粗蛋白和粗脂肪含量以及部分血清生化指标活性。此外，GSH还可诱导中华鳖肝脏sod1和sod2基因的转录表达，从而提高机体的抗氧化能力。