没食子酸对南方鲇红细胞抗氧化酶和表面形貌的影响

郭海燕，张耀光

(1.西南大学生命科学学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆市水产科学重点实验室，重庆 400715；2.重庆市水产科学研究所，重庆 400020)

没食子酸(gallic acid，GA)，又名五倍子酸、棓酸，化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸(3,4,5-Trihydroxybenzoic acid)，是自然界存在的一种多酚类化合物，广泛存在于五倍子、乌桕、诃子、葡萄、茶叶等多种天然植物中[1,2]。它因其结构本身含有三个羟基而具有较强的抗氧化性[3,4]，另外许多植物多酚类物质也被证实对多种病原菌和真菌具有抑制和杀灭作用[3-7]。在我国水产养殖上常将没食子酸或以没食子酸为有效成分的中草药用作抗菌剂防治水产动物疾病和添加到食物、饲料中阻止因脂类氧化等原因导致的腐败[8-13]。

药物和化学物质经皮肤、肠和鳃通过血液循环被输送到鱼体的其它组织，而红细胞是它们最先直接接触并受影响的细胞之一[14]。由于红细胞容易得到、易于制备、富有不饱和脂肪酸和蛋白质并且携带丰富信息，因此经常被用于进行氧化损伤的研究[15，16]。南方鲇(Silurusmeridionalis)隶属于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridae)鲇属(Silurus)，是我国长江流域特有的经济鱼类。作为水产动物常用的药物，没食子酸常被作为中草药的有效成分对水产动物进行药代动力学[11，17-19]和药效学[7，12，13，20]方面的研究，抗氧化方面的内容也有所涉及，如没食子酸在淡水鲐贝[21-23]、斑马鱼[24，25]和南方鲇[26]等方面的研究。本实验以南方鲇红细胞为实验对象研究没食子酸对红细胞抗氧化系统和表面形貌的影响作用，检测相关氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和脂类氧化(LPO)且观察红细胞相应的溶血和表面形貌的变化，以期对没食子酸对鱼类的抗氧化作用做进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源和驯养

实验用鱼为本实验室自养健康二龄南方鲇，体重(1 492.90±84.8)g，全长(55.94±0.84)cm。养殖在实验室循环水养殖系统内，养殖缸规格(80 cm×45 cm×50 cm)，每组系统上下各8个鱼缸，每缸1尾鱼，水流入速度25 mL/s，养殖用水是经脱氯、曝气、充氧的24 h循环自来水，水温控制在(26±2)℃，pH=(6.5±0.2)，溶氧大于6 mg/L，光周期设定为12 L ∶12 D。实验期间每天投喂泥鳅，投喂后及时捞走养殖系统内的粪便和残饵，日换水量约为驯化水体的10%。

1.2 红细胞悬液的制备

实验用红细胞取自本实验室循环水养殖系统自养健康南方鲇。每次正式实验前取新鲜血液，用一次性注射器尾静脉抽血至预先经肝素钠抗凝的EP管中。血液静置片刻后于4 ℃，2 500 r/min离心10 min，弃上清液。继续用0.65%灭菌生理盐水清洗2～3次至上清液呈无色透明。使用时用生理盐水制成1%的红细胞悬液，即配即用。

1.3 化学试剂和仪器

没食子酸对照品(GA，纯度为90.1%)。肝素钠购自西南大学附属医院。总蛋白、SOD、CAT、GPx和丙二醛(MDA)等试剂盒购自南京建成生物研究所。氯化钠、戊二醛、乙醇、叔丁醇、乙酸乙酯、冰醋酸等试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水。仪器包括多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific Inc，Thermo)、紫外分光光度计(UV-2450，SHIMADZU)、扫描电镜(JSM-6510LV，SHIMADZU)、离子溅射装置(INCA X-Max 250)等。

1.4 实验方法

实验方法和浓度设定参考文献[22，27]，且在其基础上有所修改。

1.4.1 没食子酸对健康南方鲇红细胞溶血的测定

制备1%红细胞悬液，加药组各管加入不同浓度没食子酸溶液，终浓度分别为5、10、20、40和80 mg/L，以不加药物加入等量的生理盐水为对照管，(27±0.5)℃分别孵育4 h和24 h，每个浓度重复三次。实验过程中，避免外力促进红细胞溶血。到达预定时间后，以1 000 r/min转速离心5 min，取上清液于540 nm处测吸光度。

1.4.2 没食子酸对健康南方鲇抗氧化酶和脂类氧化损伤的测定

制备1%红细胞悬液，加药组各管加入不同浓度没食子酸溶液，终浓度分别为5、10、20、40和80 mg/L，以不加药物加入等量的生理盐水为对照管，(27±0.5)℃分别孵育4 h和24 h，每个浓度重复三次。实验过程中，不要用力摇动EP管，避免外力促进红细胞的溶血。到达预定时间时，以1 000 r/min转速离心5 min，弃上清留红细胞沉淀，按照总蛋白、SOD、CAT和GPx及MDA试剂盒说明进行样本前处理及测定操作。总蛋白用BCA法，脂类氧化损伤用硫代巴比妥酸反应法。

1.4.3 没食子酸对健康南方鲇红细胞表面形貌的影响

取上述红细胞样品1 000 r/min，离心10 min，用生理盐水洗涤2～3次；2.5%戊二醛固定过夜，开始固定时应轻轻搅动，使样品均匀分布在固定液中，固定结束，离心后弃上清，用生理盐水清洗2～3次；30%、50%、70%、85%和95%浓度乙醇梯度脱水，逐级脱水各1次，每次浸泡10 mim，离心5 min，再用100%乙醇脱水两次；用叔丁醇转换2次，每次30 min，-20 ℃冰箱保存；-80 ℃冷冻干燥；将干燥完的样品放入离子溅射装置喷金150 s，扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)观察拍照。

1.5 数据处理

实验数据按试剂盒说明书给定的公式进行计算，常规计算用EXCEL，后用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。全文数据以平均值±标准误(mean±SE)表示，统计上显著性水平为P<0.05。

2 结果

2.1 没食子酸对南方鲇红细胞溶血的影响

(27±0.5)℃时健康南方鲇正常红细胞分别在0、5、10、20、40和80 mg/L没食子酸溶液中孵育4 h和24 h溶血情况如图1。4 h组各浓度之间红细胞溶血均不具有统计学意义差异，24 h组随着没食子酸浓度增大红细胞溶血OD先降低后升高，与对照组相比，5 和10 mg/L浓度组溶血显著降低，40 和80 mg/L 浓度组溶血显著升高。

图1 没食子酸对南方鲇红细胞溶血情况的影响

2.2 没食子酸对南方鲇红细胞抗氧化酶的影响

(27±0.5)℃时健康南方鲇正常红细胞分别在0、5、10、20、40和80 mg/L没食子酸溶液中孵育 4 h和24 h抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)的变化趋势如图2所示。SOD活力在4 h先升高再降低的趋势，24 h时5 mg/L浓度组比对照组略有下降，接着上升然后再下降，两组均在20 mg/L时达到最大值。CAT 活力在4 h时5、10 和20 mg/L浓度组与对照组差异不显著，40与80 mg/L比20 mg/L显著下降，但与对照组差异不显著；24 h时随着没食子酸浓度的增大，CAT活力呈先升高再降低的趋势变得比较明显，最大值在20 mg/L时出现。GPx活力在4 h时5、10和20 mg/L浓度组比对照组有所增大，但是各浓度组之间差异不显著，40和80 mg/L比对照组显著降低；24 h时5、10和20 mg/L浓度组比对照组显著升高，且10和20 mg/L之间差异不显著，接着活力下降。并且三种酶同一浓度的酶活性24 h时比4 h时均有不同程度地降低。

图2 没食子酸对南方鲇红细胞SOD、CAT及GPx活性的影响

2.3 没食子酸对南方鲇红细胞脂类过氧化的影响

MDA是硫代巴比妥酸反应的产物，它的含量可以反映机体脂类氧化的程度。经测定，(27±0.5)℃时健康南方鲇正常红细胞分别在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h MDA的水平随着没食子酸浓度的增大先降低后增大，4 h时20 mg/L MDA含量为最小，24 h时20 mg/L MDA含量达到最小，40和80 mg/L显著高于对照组，而且同一浓度24 h的MDA含量远远大于4 h时的含量(图3)。

图3 没食子酸对南方鲇红细胞MDA含量的影响

2.4 没食子酸对南方鲇红细胞表面形貌的影响

分别在0、5、10、20、40和80 mg/L GA溶液中孵育 4 h和24 h，扫描电镜下正常红细胞呈卵圆形或椭圆形，表面光滑，均匀饱满无可见的表面损伤。4 h除80 mg/L浓度组可以看到少数红细胞表面略有皱缩变形，其它组与对照组无差异。24 h时 5、10、20 mg/L浓度组与对照组相比红细胞均无变化，40和80 mg/L浓度组红细胞表面损伤逐渐明显，尤其是80 mg/L浓度组视野范围内的红细胞显著减少，(27±0.5)℃时健康南方鲇正常红细胞40和80 mg/L浓度组红细胞的SEM表面形貌如图4。

图4 没食子酸对南方鲇红细胞表面形貌的影响

3 讨论

红细胞是机体血液循环系统维持内环境稳定、运输、调节、防御等功能的重要体现者，且红细胞对氧化损伤作用极为敏感[28]。过氧化损伤的产生主要是由于内源性或外源性的某些物质，在一定条件下产生一系列过氧化反应生成自由基产物，如活性氧等，引起红细胞膜磷脂不饱和脂肪酸发生过氧化反应，使膜磷脂组成发生改变，即不饱和脂肪酸比例降低，饱和脂肪酸比例增加，脂质过氧化还可以引起膜硬度的增加，从而导致红细胞膜流动性降低，最终导致溶血[28]。为了对抗这些活性氧，机体为红细胞配备了有效的酶和非酶抗氧化剂。SOD、CAT和GPx就是其中三种重要的抗氧化酶[29]。MDA的测定通常与抗氧化酶的测定相互配合来诠释机体或细胞氧化水平。红细胞表面形貌的变化通常在医学、化学和新材料学上应用较多[28]，水产上较少应用。

3.1 没食子酸对南方鲇红细胞溶血和细胞存活率的影响

红细胞溶血常用来计算红细胞的存活率。4 h各浓度组红细胞的溶血与对照组比较均没有显著差异，这说明各浓度组之间红细胞的存活率是一致的，没食子酸对红细胞没有明显的细胞毒性，但此时抗氧化酶和脂类氧化的指标已经有一定的变化。24 h随着浓度增大红细胞的存活率先升高后降低。从红细胞溶血的角度观察，在较低浓度时(5和10 mg/L)时没食子酸对南方鲇红细胞有抗氧化作用而显示出一定的保护作用，而在较高浓度时(40和80 mg/L)显示出明显的细胞毒性而导致红细胞大量溶血。从图1中看到，同一浓度的吸光度无论是未给药组还是给药组，24 h组均相应地大于4 h组，说明时间是红细胞溶血和细胞存活率的重要因素。Yen等[30]研究发现37 ℃时人类正常淋巴细胞在0～0.24 mmol/L GA溶液中孵育30 min时未发现没食子酸对其有明显的细胞毒作用。Labieniec等[21]提出当淡水贝类消化腺细胞在多酚类物质中孵育呈现出时间和浓度依赖性地减少，表现出一定的细胞毒性的特征但并未显示出明显的细胞毒性。这些研究都说明没食子酸对细胞的存活率的影响与浓度、时间有一定关系。

3.2 没食子酸对南方鲇红细胞抗氧化酶的影响

Gil-Longo等[27]报道没食子酸自氧化过程中会产生超氧负离子、过氧化氢和奎宁等活性氧，本实验的结果说明了抗氧化酶的活性与活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成过程与没食子酸的浓度相关的。实验数据显示没食子酸对南方鲇红细胞的SOD、CAT和GPx活性有时间和浓度依赖性的影响。这与Techer等[24]研究GA对斑马鱼(组织匀浆物)的抗氧化酶活性的影响是非常一致的，均以20 mg/L或40 mg/L浓度时酶活性达到最大值，随后降低，酶活性显著被抑制的最低浓度是45 mg/L。本研究中三种酶在20 mg/L或以下的浓度时酶活性与对照组相比均有不同程度地显著升高，而在20 mg/L浓度或以上的浓度时酶活性有所降低，这说明GA对南方鲇红细胞的氧化作用有两面性，结果显示20 mg/L以下有抗氧化作用，而20 mg/L以上有促氧化作用。

3.3 没食子酸对南方鲇红细胞脂类过氧化的影响

Li等[4]研究发现没食子酸喂饲雄性快速老化小鼠30 d时，脑和肝里MDA水平比正常鼠有所降低。Yen等[30]研究Fe3+-H2O2介导的人淋巴细胞的氧化损伤时发现随着没食子酸浓度的增大(0.004～0.82 mmol/L)硫代巴比妥酸的生成增大，并且最大值的出现大于1.65 mmol/L，随后TBARS的生成开始变小，说明没食子酸对氧化损伤的保护作用有一定的浓度依赖。Gupta等[31]指出高浓度的多酚类物质自身能产生一定的毒性。本实验的结果与这些理论吻合，较低浓度时(20 mg/L及以下浓度)没食子酸可以降低南方鲇红细胞脂类的氧化，而40 mg/L及以上浓度能促使脂类的进一步氧化。因此说较低浓度时没食子酸对南方鲇的红细胞有一定的保护作用。

3.4 没食子酸对南方鲇红细胞表面形貌的影响

红细胞膜由整齐有序的磷脂双分子层骨架和膜表面附着的外周蛋白共同组成，外界因素影响使其整齐有序性受到破坏，从而影响其正常功能[28,32]，进一步会导致表面形貌的变化。红细胞在氧化过程中产生过多的活性氧对其脂质和蛋白质造成了损伤，Labieniec等[22]就多酚类物质对淡水鲐贝消化腺细胞膜脂质的流动性的研究中建议此类物质的膜脂质的流动性依赖于它们的化学结构(多羟基的数量和极性)，推测它们结合蛋白质的能力是导致膜质流动性和表面形貌变化的主要原因，但是质膜的水合部分流动性的原理还有待进一步研究。本研究结果显示，低浓度时没食子酸会对红细胞的氧化有一定的保护作用，它们可以修饰某些蛋白，使它们结构松散，而高浓度时它们大部分覆盖在蛋白表面，使它们的结构变得不稳定而导致膜质流动[33]，达到一定浓度时即体现在红细胞的表面形貌上。另据报道多酚类物质能与多种金属螯合[15]，如Fe3+、Cu2+和Ca2+等，而Ca2+在细胞膜的稳定方面起重要作用，这可能也是没食子酸影响红细胞表面形貌变化的原因之一。而红细胞表面形貌的变化也正说明了细胞结构和功能的一致性。