血鹦鹉鱼鳞片及色素细胞的显微和超微结构研究

周康奇，潘贤辉，牟春艳，郑曙明

(1.西南大学，鱼类繁育与健康养殖研究中心，重庆 402460；2.广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁 530021)

鱼类鳞片与哺乳动物的指甲、毛发一样，都是由皮肤的原始干细胞经定向分化形成的衍生物，具有重要的生物学意义[1,2]。鳞片本身具有维持体形骨架、减少游动摩擦以及防御病原侵害等功能，其形态结构还可作为鱼类分类特征、生长特征和生存环境的重要依据[3,4]。鳞片上分布着许多色素细胞，使得鱼类呈现出不同的体色，鱼类体表颜色在一定程度上具有保护自己、攻击或迷惑对方以及逃避敌害的作用[5]。鳞片及其色素细胞一直是鱼类学和鱼类生理学重要的研究对象之一。通过对鳞片形态结构的研究，有助于鉴定鱼类亲缘关系以及判断鱼的生长状况和培育效果[6,7]；对鳞片色素细胞形态特征的观察，可探索色素细胞的发育情况，为此可制定出合理的增色措施，对于观赏鱼的养殖具有重要的指导意义[8]。

血鹦鹉鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)慈鲷科(Cichlidae)，由红头丽体鱼(Viejasynspila♀)和橘色双冠丽鱼(Amphilophuscitrinellus♂)杂交得到。其体幅宽厚尾柄短，鳍条柔软，上下颌厚实无法闭合，长相似鹦鹉，全身体色通红故名血鹦鹉，是一种被大众喜爱的淡水热带观赏鱼，具有广阔的市场前景[9]。血鹦鹉成长阶段存在体色褪黑现象，体色有黑色-灰色-黄色-红色四个过渡阶段，前期褪黑不完全的血鹦鹉鱼，后期进行扬色处理也无法将黑色褪去。为培育出体色均匀、色质通红的血鹦鹉鱼，国内诸多学者针对血鹦鹉的人工繁殖、养殖以及鱼体增色机制等开展了大量研究工作[9-14]，目前，关于血鹦鹉鱼在生长各阶段的鳞片及其色素细胞的显微和超微结构观察还未见报道。本试验拟通过对生长各阶段的血鹦鹉鱼鳞片及其色素细胞显微和超微形态进行研究，以阐述血鹦鹉鱼鳞片及其色素细胞形态结构和生理机能的关系，探讨血鹦鹉鱼鳞片显微和超微形态特征在分类学、生理学上的意义，旨在为血鹦鹉鱼行为、分类、进化研究提供一定的理论依据，亦丰富血鹦鹉鱼鳞片及色素细胞发育的生物学材料。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用血鹦鹉鱼从重庆南岸区海珍热带鱼养殖场购得，包括黑色(7±0.5)cm、灰色(7.5±0.5)cm、黄色(8.5±0.5)cm和红色(9.0±0.5)cm各20尾，暂养于西南大学动物科学学院鱼类繁育与健康养殖中心水族箱(120 cm×60 cm×60 cm)中，养殖水温25～28 ℃。

所用试剂：重铬酸钾、无水乙醇、戊二醛、PBS、四氧化锇、环氧树脂、醋酸铀、枸缘酸铅。

1.2 实验方法

1.2.1 显微观察

分别挑选黑、灰、黄和红4种体色血鹦鹉鱼(图1)，要求色彩鲜艳、体型饱满、体健无伤的活体试验鱼进行取样。分别取背鳍起点垂直下方、侧线、腹鳍基部和尾鳍基部处的鳞片。载玻片和盖玻片用重铬酸钾浸泡24 h后取出，用清水清洗，放入75%乙醇的浸泡液中浸泡3～4 h备用。从浸泡液中取出取载玻片和盖玻片，用软布擦净，再用胶头滴管在载玻片上滴上适量蒸馏水，接着将清洗后的样品放在上面；夹取一片擦净的盖玻片，倾斜45°与小水滴接触，之后缓慢放下盖玻片，轻按，保证盖玻片下无气泡。拍摄在Olympus BX51TF正置生物显微镜和CCD拍照系统自带显微图像处理软件配合下完成。

图1 血鹦鹉鱼生长阶段体色变化

1.2.1 透射电镜观察

分别在4种体色血鹦鹉鱼(活体)的背鳍起点垂直下方位置，将鳞片取下，用锋利的双面刀片的一侧,将鳞片后缘中部切成1 mm×1 mm 正方形组织块，即刻用牙签将组织块挑置于4%戊二醛(固定液)中固定，4 ℃保存。将样本用0.1 mol/L PBS清洗三次，接着用1%四氧化锇固定2 h，再用常规乙醇和四氧化锇梯度脱水，环氧树脂浸透、包埋、聚合，制备成0.5 μm厚度半薄切片光镜定位后，再制备成60 nm厚度超薄切片，用醋酸铀和枸缘酸铅染色后即可观察。样品在JEM-1400PLUS型透射电子显微镜(日本HITACHI)下观察拍照。

2 结果

2.1 血鹦鹉鱼鳞片的显微结构

观察发现血鹦鹉鱼鳞片整体呈卵圆形，覆瓦状排列，鳞片露出的部分的边缘有密生的辐射型细齿。顶区和基区的凸起均较不明显，横轴和纵轴的比值接近1，为等比型鳞片(图2-A)。低倍镜下观察鳞焦，其区域面积相对较小且平坦，为亚基位类型，鳞焦至基区边缘距(r1)与鳞焦至顶区边缘距(r2)的比值(r1/r2)介于30%～70%。高倍镜下观察到鳞焦为短嵴型，在鳞焦处有明显的不规则短嵴(图2-B)。

在鳞片的不同区域，鳞嵴的形态和排列方式存在差异。鳞嵴从鳞焦辐射开来，沿顶区边缘呈波浪形状排列。鳞嵴被鳞沟隔断开，呈不连续分布。相对整体而言，顶区的鳞嵴较明显，鳞嵴排列规则、紧密且始终清晰可辨。鳞嵴在靠近鳞焦处间距较大，在靠近顶区边缘处间距较小。顶区的鳞嵴均有齿状突起(图2-C)，但排列无规律疏密不一,基区鳞嵴整体间距比顶区和侧区大，有些部分模糊、不规则、不完整 ,鳞嵴上的齿状突起的较明显，且更细长，甚至有的齿状突起伸展出去，为细长的分枝状。侧区鳞嵴整体间距较顶区的大，但较基区的小，平直且清晰，呈平行、规则、均匀、紧密排列，鳞嵴及其齿状突起的排列与基区相似。

鳞沟在顶区和两个侧区都有分布，但多集中在顶区。鳞沟大多从鳞焦出发，一直延伸到顶区的外缘或至中途消失；少数鳞沟从距鳞焦附近出发，中途消失。

2.2 血鹦鹉鱼鳞片色素细胞显微、超微结构

观察发现鳞片上有黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞和虹彩细胞4种色素细胞(图2-C)。含色素区域主要呈半月状分布在基区(图2-A)。鱼体各部位鳞片上的色素细胞形态、大小、数量有差异。在黄色和红色鱼体上，背鳍基部的鳞片上的色素细胞比其它部位个体大，颜色深，且分布较均匀；而黑灰色带斑纹的鱼存在这现象的鳞片处于斑纹处。在靠近基区的黑色素细胞个体较小，细胞直径1～50 μm，呈球形或者树突状，分枝不明显，色素颗粒聚集，细胞颜色较深(图2-D)；靠近鳞焦的黑色素细胞个体较大，细胞直径60～150 μm，呈树突或者放射状，分枝明显且细长，色素颗粒分散，细胞颜色呈黑色或者棕色(图2-G)。

黄色素细胞位于黑色素细胞的下层，形态多样，在鱼体发育各阶段细胞形态存在差异。黑黄色鱼体上的黄色素细胞多为球形或圆点状，细胞个体小，直径20～40 μm，分布较均匀(图2-E)；黄色鱼体上的黄色素细胞多为不规则的团块状，弥散分布着，细胞边界不清(图2-H)。红色素细胞在个体较小的红色鱼体，色素细胞多为树突或放射状，细胞有明显分枝，直径20～120 μm(图2-F)；个体较大的红色鱼体，色素细胞间分界不清晰，细胞成片连接，细胞中心部分颜色较深，边缘颜色逐渐变浅且带有黄色(图2-I)。虹彩细胞在40倍透射光下才能观察到，它存在于其他三种色素细胞的间隙或者下层。呈现出多种色彩，有蓝绿色、紫色、黄绿色或者其他颜色。形状为小颗粒状，少有分散，多成团分布在红、黑、黄色素细胞周围(图2-C)，其中多成团出现在放射状黑色素细胞的中心处(图2-D，图2-G)。虹彩细胞在不同放大倍率显微镜下呈现细微的折射差异。

图2 血鹦鹉鱼鳞片及其色素细胞显微结构

另外，在显微镜下观察刚从实验鱼体取下的鳞片，分布在鳞片上的黑、黄、红三种色素颗粒可随细胞质的运动发生一些小范围的移动，或者单个小颗粒在不停的闪动，而虹彩细胞未发现移动。

通过透射电镜对样品进行超微结构观察，观察到黑色素细胞和虹彩细胞内部的黑色素颗粒和反光体。黑色素细胞切割处理后在电镜下可观察到胞囊包裹着密集的黑色素颗粒群体，细胞外也有一些黑色素颗粒散落，黑色素颗粒呈球形或椭圆形，颗粒直径0.2～0.8 μm(图3-J、K、L、N中PG)。黑色素颗粒大概分为两种状态，一种普遍较大，颗粒较立体，颗粒边缘颜色较深而内部颜色逐渐变浅(图3-K、N中PG1)；另一种形态较小，颗粒整体颜色较深且均匀，颗粒边缘模糊不清(图3-K、N中PG2)。在30 000倍电镜下可观察到在黑色素细胞的细胞质里(即黑色素颗粒之间)的线粒体，在黑色素细胞间发现质膜(图3-N中Me)。

在电镜下可观察到虹彩细胞的结晶板，单个反光小板形状为棍棒状或杆状，银白色，长0.5～2.2 μm，其中每一个反光小板两端有类似于小帽的顶端结构。反光小板平行排列，长短不一，反光小板反射出两种亮度不同的银白色光。细胞内平行排列的反光小板之间或周围有许多小囊泡，直径约0.2 μm(图3-M)。

图3 血鹦鹉鱼鳞片及其色素细胞超微结构

2.3 鳞片上细胞连接的超微结构

通过25 000倍透射电镜可观察到血鹦鹉鱼鳞片之间的细胞连接结构，包括桥粒、紧密连接和中间连接等。电镜下的紧密连接封闭近官腔面细胞之间的空隙,中间连接位于紧密连接的下方，此处两侧有深暗的致密物质，两侧有微丝(microfilament)。桥粒位于中间连接的深部，呈椭圆形斑状，每个桥粒紧紧贴在两细胞间，间隙宽0.1～0.25 μm。桥粒较细胞质等周边物质颜色深，每个附着斑之间的距离不等，附着斑上可清楚观察到其周围汇集很多张力微丝。在两细胞膜间隙中央有一条与膜平行的中间线(intermediate line)(图3-O)。

3 讨论

3.1 血鹦鹉鱼鳞片的显微结构

鱼类鳞片为皮肤的衍生物，由真皮产生，由钙质所组成，质地较坚硬，覆盖在鱼体体表，具有保护作用[15]。由于鱼鳞含有大量的包括鱼鳞胶原和羟基磷灰石在内的有效成分，所以被认为是十分具有潜力的生物材料[16]。本次试验观察血鹦鹉鱼鳞片，判断为等比型鳞片；露出细齿为辐射型；色素区域集中在基区，鳞沟多在顶区，鳞焦为亚基位型鳞焦，鳞焦为短嵴型，通过鳞片特征判断属于栉鳞，分类地位与鱼类学分类地位相一致[5]。血鹦鹉鱼鳞嵴在各区排列方式不同，在顶区鳞嵴从鳞焦辐射开来，沿顶区边边缘呈波浪形状排列，鳞嵴间隔较小；在基区和侧区鳞嵴上的排列更均匀和规则，鳞嵴整体间距较大，李奇生等[17]研究认为发达的鳞嵴能够保护身体、减少损伤和减少刺激。Delamater等[18]用扫描电镜研究罗非鱼等9种鱼类鳞片的形态特征,认为齿状粒突和鳞片后区的栉齿具有种属间的形态差异,能够显示各种属间系统发育的亲缘关系,有助于分类鉴定。本试验在鳞嵴在各区也均发现有齿状粒突，基区齿状粒突更细长，但排列方式无规律，疏密不一。根据鳞嵴间距和齿状粒突形态特征分析，血鹦鹉鱼可能喜欢生活在水流缓慢的环境中。

3.2 血鹦鹉鱼鳞片色素细胞显微、超微结构

根据色素细胞所含的色素颗粒、光反射器官及运动性等特性，可将色素细胞分为四类：黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞[19,20]。由于这4类色素细胞在鱼体表层上的分布和数量有差异，所以可使鱼体表显现出不同的体色和斑纹[21,22]。本次通过光镜观察到黑色素细胞的两种细胞类型：一种细胞体积小，色素颗粒集中颜色深，呈球形，分支细小；另一种细胞体积大，色素颗粒分散颜色浅、呈放射状，分支长。徐伟等[23]、李小兵等[24]分别在鲤鲫鱼鳞片和曼龙鱼鳍上通过显微镜观察的相类似的两种黑色素细胞形态。徐伟等[23]认为这两种类型的黑色素细胞是鱼体鳞片表现出网纹结构的原因。李小兵等[24]认为体积小、分支少的色素细胞可能是处于生长期，而体积大分支粗大的一类是较成熟的黑色素细胞。Fujii[25,26]认为鱼体在不同应激条件下会出现相应的应激反应，从而导致色素颗粒迅速的分散与集结；集结时鱼体体表颜色变浅，分散时变黑。黑色素细胞易受到神经传导物质神经荷尔蒙的影响使其收缩或舒张，收缩即黑色素颗粒沿着从细胞中心辐射出的微管向细胞中心移动，反之为舒张[17]。结合电镜所观察黑色素细胞的内部结构，发现黑色素细胞里的颗粒也有两种类型：一种普遍较大，颗粒较立体，颗粒边缘颜色较深而内部颜色逐渐变浅；另一种形态较小，颗粒整体颜色较深且均匀，颗粒边缘模糊不清。黑色素细胞含有黑素蛋白，存储在为黑色素的细胞器[25]。黑色素细胞含有高电子密度黑素蛋白沉积物，从而呈现出黑色[27]。Ida Djurdevic[28]对大理石鳟和褐鳟两种大马哈鱼的皮肤进行了超微结构观察，结果表明不同距离的色素细胞间的相互作用，能促进成熟色素细胞图案的形成，色素细胞之间也是相互影响的。目前关于两种黑色素颗粒形态还未见报道，推测呈现这两种形态的黑色素颗粒存在三种原因：其一在光镜下观察色素颗粒，由于颗粒分为外层和内层，电子显微镜聚焦不同造成；其二每个色素颗粒处在生理的不同阶段，较小形态的色素颗粒可能是正在退化、凋亡或者正在生长的阶段，而较大形态的色素颗粒可能为最鼎盛阶段[29]；其三两种形态色素颗粒确实为不同类型，其所含的化学成分等有微量不同，从而造成了颜色、大小、形态的差异。所以结合显微和超微结构的观察，推测黑色素细胞和颗粒呈现的两种类型很可能是细胞和颗粒处在不同的生长阶段、对应激产生反应及细胞间相互影响等多个因素共同作用的结果。

黄色素细胞有两种类型，一类为黄素体(也称蝶呤体)，储存碟啶；另一类为类胡萝卜素小囊泡[30,31]。有研究表明：红色素细胞和黄色素细胞区分不明确，是人主观的根据黄素体和类胡萝卜囊泡数量类型确定[28,31]。黄色素细胞和红色素细胞在显微观察时较易判断，电镜观察时较难区分，两者的区别是按类胡萝卜素囊泡和黄素体相对比例来区分的，且电镜所见无法区分彩色，所以在透射电镜观察、区分红、黄两种色素细胞及其色素颗粒时，可能判断会比较武断[28]。也就是说，许多红色素细胞的研究也许就描述了黄色素细胞非常相似的色素细胞超微结构。在本次显微镜观察时也出现了红色和黄色素细胞弥散交融在一起，两者难以分清界限的现象(图2-I)。本次电镜观察未观察到黄素体和胡萝卜素小囊泡结构，可能是由于切片不当造成的。

虹彩细胞又称为白色素细胞或者鸟粪素[25]，根据其大小可分为两种：L型大小为10～20 μm，S型>50 μm，在光学显微镜下呈蓝色、紫色或其他鲜亮颜色，形状不规则，细胞核为椭圆形，细胞质具有多六边形的反射板，能与水结合形成晶体鸟嘌呤，相互排列形成光反射层，反射光成色[32,33]。研究者曾在在鲽鱼身上只观察到了长六边形S型的虹彩细胞，在斑马鱼皮肤上观察到了S型蓝紫色虹彩细胞和长六边形S型虹彩细胞[32]。Ida Djurdjevic[28]在大理石鳟和褐鳟两种大马哈鱼的鳞片和皮肤上也观察到了以上两种形态的虹彩，且L型虹彩细胞多存在于放射状的黑色素细胞中心，与本次在血鹦鹉鱼鳞片上观察到的虹彩细胞类型、位置基本一致。本次研究未在血鹦鹉鱼鳞片上发现S型的虹彩细胞，且虹彩细胞总体数量少、个体小，推测可能与血鹦鹉鱼生活习性相关，如鲫、斑马鱼、大马哈鱼都是游动速度极快的鱼类，喜欢生活在水流较急的水域里，身体颜色鲜亮，鳞片皮肤都有明显反光的银色，这种体色能更好地保护自己在水域里活动和躲避敌害，所以虹彩细胞比较发达，个体较大、数量较多，类型也较丰富；而血鹦鹉鱼正好相反，喜欢在静水中生活，游动不迅速，体色较前三种暗淡，所以虹彩细胞不是很发达，数量少、个体小。虹彩细胞的反光组织形状为独特的结晶板[34]。电镜下观察到的虹彩细胞内的结晶板完整时为灰白或银白色，但被切割的结晶板反射出更耀眼的亮白色。这个现象说明有可能每个结晶板表面有一个包裹的类似于膜的物质，将嘌呤等内含物包裹其中，但依然能反射一定的光[35]。当结晶板被切割后，膜里面嘌内含物裸露出来反射更强的光，所以呈现更耀眼的亮白色。结晶板两端观察到有帽子状的顶端结构，周边具有线粒体和贴着质膜的小囊泡，我们推测这可能与结晶板的合成等生理机能有关。且在其细胞质内及色素颗粒间含有大量线粒体，推测线粒体可能与胞内色素颗粒的形成、变化有关。

鱼的颜色是由很多种类不同的色素细胞叠合而来。种类不同的色素细胞在平面上的排列方式、立体的堆叠都会形成不同的色彩[27]。甚至有些是同一色素细胞内含有不同颜色的胞器进而产生不同的色彩(如红色素细胞、黄色素细胞内所含不同比例的碟呤体和类胡萝卜素小囊泡)。如剑鱼(Xiphophorushelleri)的红色素细胞同时存在两种颜色不同的胞器，分别为红棕色的碟呤体和黄色类胡萝卜素小囊泡，使红色素细胞呈橘红色[36]。许多鱼类如金鱼、锦鲤等呈现双闪的红色和黄色，是由于红色素细胞或黄色素细胞下面还存在的一层虹彩细胞的缘故。蓝刻齿雀鲷(Chrysipteracyanea)呈现绚丽的蓝色是由于双层色素细胞的结构造成，体表虹彩细胞形成的蓝色被排列在下方的黑色素细胞进一步强化，受到黑色素细胞的影响，虹彩细胞反射的蓝色更加饱满艳丽[37]。而如橘色等不属于任何一种色素细胞本身的颜色，通常是由不同种类的色素细胞以平行排列、镶嵌的方式形成。如颊鳞雀鲷(Pomacentruslepidogenys)中含有放射状和圆形两种不同的虹彩细胞，不同种类的虹彩细胞聚集成小于100 μm的团状结构，当放射状的虹彩细胞上覆盖黄色素细胞时形成亮黄色色调，圆形虹彩细胞反射的光线多在蓝色及绿色之间，两种不同色素细胞形成的颜色宏观上看起来就成了黄绿色[37]。位于黑色素细胞中心正上方的虹彩细胞形成蓝色到黄色之间的颜色，而位于黑色素细胞树枝状分枝正上方的虹彩细胞则形成淡黄色，当虹彩细胞反射出的蓝色与黄色同时存在时，鱼体就出现绿色。本次试验也观察到类似现象，成团分布在红、黑、黄色素细胞周围(图2-C)的虹彩细胞，以及位于放射状黑色素细胞的中心处成团的虹彩细胞(图2-D,G)呈现蓝色到黄色之间颜色。

3.3 色素细胞变化

色素细胞具有移动能力，不同距离的色素细胞间能够相互作用，能促进成熟色素细胞图案的形成[30]；细胞内色素颗粒也能移动。细胞内的胞器沿着细胞骨架(微管、微丝、中间线)进行有方向性的移动[25,38]。本次试验在显微镜下发现鳞片上的黑、黄、红三种色素颗粒可随细胞质的运动发生一些小范围的移动，细胞均能变形。如细胞膨大则色素展开，体色格外鲜艳，反之色素细胞收缩，色素隐没，体色亦随之暗淡或隐没。鱼类色彩、浓淡的变化是这些细胞扩散、收缩位移的结果。例如黄色素颗粒在扩散透色射光下呈淡黄色或橙色，收缩时变密集呈深橙色或红色[5]。色素颗粒的运动系由节后神经纤维所控制，在鱼类的延脑前方有一调节中枢，一旦受刺激，则全身黑色素细胞的色素颗粒集中而使体色变淡，同时在间脑也有一中枢起着与上述相反的颉颃作用[39]。更微观地看来，鱼受到外界刺激后产生应激反应后，通过神经-体液调节，细胞膨胀，囊泡体积变大，囊泡内色素含量减少，导致颜色发生变淡；反之细胞收缩后囊泡变小则颜色增加[40]。林永丰[27]认为黑色素细胞易受到神经传导性物质与神经荷尔蒙的影响，使其收缩或扩张，收缩是黑色颗粒沿着细胞中心辐射出来的微管往细胞中心移动，扩张为黑色颗粒沿着微管向细胞外移动。电镜下观察到散落在细胞膜外的黑色素颗粒，推测这可能体现了色素颗粒胞吐的排出方式，这种分泌方式将黑色素颗粒从胞囊由内到外排出去，使色素颗粒产生集散，从而使鱼的体色变浅或者变淡。

3.4 鳞片上细胞连接的超微结构特征

细胞连接是通过膜蛋白、细胞骨架或者胞外基质形成的细胞之间、细胞与胞外基质之间的连接结构，根据形式功能的不同，分为封闭连接、锚定连接和通讯连接。其中紧密连接是封闭连接的主要类型。锚定连接又分为与中间丝相关的锚定连接，比如桥粒和半桥粒；以及与肌动蛋白纤维相关的锚定连接，比如黏着带和黏着斑[41]。桥粒是上皮细胞所特有的一种细胞间粘着结构，起到细胞之间连接作用。桥粒不仅为中间丝在细胞表面的主要锚定位点，还有传导调节细胞行为的细胞内信号功能。桥粒是角质形成细胞之间的黏着连接结构，其表面的张力微丝可加强桥粒的韧性，即起到保持细胞形态的作用[42]。此外，郑敏等[43]发现人体癌细胞不仅有表面的桥粒，而且都有胞质桥粒，胞质桥粒的形成在癌细胞完全分裂之后根据细胞自身机能的需要产生。本次研究通过电镜，观察到血鹦鹉鱼鳞片的桥粒为表面桥粒。紧密连接、中间连接和桥粒三者通过联合，形成了一个连接的复合体，将相邻细胞细胞间以纽扣式把细胞连接起来，这样与表面张力微丝共同作用，起到了增强细胞间结构的作用。