高效液相色谱法测定阿比特龙的纯度

2020-09-26韦林洪徐志英丁娟芳刘苏闽张军

化学分析计量 2020年5期

韦林洪，徐志英，丁娟芳，刘苏闽，张军

（1.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州 225009； 2.扬州市职业大学园林园艺学院，江苏扬州 225009；3.扬州市职业大学科技产业处，江苏扬州 225009）

2011 年美国FDA 批准阿比特龙乙酸酯（商品名为Zytiga）与泼尼松、强的松、多西他赛等药物联用治疗去势抵抗性前列腺癌［1–8］，阿比特龙（Abiraterone）是生产阿比特龙乙酸酯的主要原料，其化学名称为17-（3-吡啶基）雄甾-5，16-二烯-3β-醇，它通过抑制细胞色素氧化酶（P450C17）的活性阻断雄性激素的生成。药物的含量是评价其质量的重要指标，也是制剂生产时计算投料量的依据，因此，测定阿比特龙的含量对于监控原料的质量及制剂的生产非常重要。

美国药典（USP 40）收载了阿比特龙乙酸酯及其片剂的检测方法［9］，但未收载阿比特龙的检测方法，也未见其它药典收载阿比特龙的检测方法。有采用高效液相色谱法［10–11］、质谱法［12］和液相色谱–质谱联用法［13–15］测定血浆样品中阿比特龙及其代谢物含量的报道，但未见文献报道阿比特龙含量测定的方法。龚爱琴等［4］采用高效液相色谱法测定阿比特龙乙酸酯的含量并对分析方法进行验证，该法能同时分离阿比特龙和阿比特龙乙酸酯，但文献并未用此法测定阿比特龙的含量。笔者建立了高效液相色谱法测定阿比特龙原料药中阿比特龙的含量并进行了方法学验证。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 型，配G1312B型二元泵、G1314F 型变波长检测器、G1329B 型自动进样器、G1316A 型柱温箱和Agilent Chemstation工作站，美国安捷伦科技有限公司；

分析天平：AR2140 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒·托利多公司；

高功率数控超声波清洗器：KQ–400KDE 型，昆山超声仪器有限公司；

阿比特龙标准样品：纯度为99.7%，批号为A0534，上海惠诚生物科技有限公司；

阿比特龙样品：药物原料，批号分别为20160811，20160814，20160820，扬州联澳生物医药有限公司；乙腈：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水：屈臣氏蒸馏水。

1.2 溶液配制

阿比特龙标准样品储备液：0.8 mg／mL，精确称取阿比特龙标准样品40 mg，用乙腈–水（7∶3）稀释至50 mL，摇匀。

阿比特龙标准样品溶液：0.4 mg／mL，取阿比特龙标准样品储备液5 mL，用乙腈–水（7∶3）稀释至10 mL，摇匀。

阿比特龙样品溶液：0.4 mg／mL，精密称取阿比特龙样品20 mg，用乙腈–水（7∶3）稀释至50 mL，摇匀。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；检测波长：254 nm；柱温：25℃；流动相：乙腈–水（1∶1）溶液，流量为1.2 mL／min；进样体积：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

改变色谱条件对阿比特龙样品溶液进行分析，以考察色谱条件变化对测定结果的影响。色谱条件变化如下：（1）分别选用美国安捷伦科技有限公司的Agilent C18型色谱柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm) 和Agilent ZorbaxSB C18型色谱柱(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm)；（2）柱温分别设置为25，30，35℃；（3）流动相流量分别设定为1.0，1.2，1.4 mL／min；（4）流动相中乙腈的体积分数分别设定为45%，50%，55%。试验结果表明，在以上范围内改变色谱条件，理论塔板数和拖尾因子均能满足分析要求，不同条件下测得样品含量为98.68%～99.54%。Agilent C18色谱柱柱效略优于Agilent ZorbaxSB C18色谱柱；为了节省能源、便于操作，色谱柱温选择25℃；为了提高分析方法的稳定性和耐用性，流动相流量及流动相中乙腈的体积分数均采用中位值。

2.2 系统适应性试验

取2 份阿比特龙标准样品溶液，在1.3 色谱条件下，分别进样乙腈–水（7∶3）1 次、第1 份阿比特龙标准样品溶液进样5 次、第2 份阿比特龙标准样品溶液进样1 次。试验结果表明：阿比特龙的保留时间为8.322 min，稀释剂乙腈–水（7∶3）中没有与阿比特龙色谱峰保留时间相同的成分，第1 份阿比特龙标准样品5 次进样色谱峰面积的相对标准偏差为0.38%，2 份阿比特龙标准样品溶液的主色谱峰保留时间相同，理论塔板数以阿比特龙计大于5 000，拖尾因子0.80。系统适应性试验符合要求。

2.3 专属性试验

精密称取阿比特龙样品20 mg 于6 只50 mL容量瓶中，分别进行以下破坏性处理：

（1）酸破坏：将阿比特龙样品用5 mL 乙腈–水（7∶3）溶解，加入0.5 mol／L 盐酸溶液2 mL，于室温下放置2 h，用0.5 mol／L 氢氧化钠溶液调节至中性。

（2）碱破坏：将阿比特龙样品用5 mL 乙腈–水（7∶3）溶解，加入0.5 mol／L 氢氧化钠溶液2 mL，于室温下放置2 h，用0.5 mol／L 盐酸溶液调节至中性。

（3）氧化破坏：将供试品用5 mL乙腈–水（7∶3）溶解，加入30%的过氧化氢溶液2 mL，于室温下放置2 h。

（4）高温破坏：将供试品用5 mL乙腈–水（7∶3）溶解，于90℃水浴加热2 h，放冷至室温。

（5）光照破坏：将供试品于紫外光下照射5 h。

（6）高湿破坏：将供试品置于相对湿度为（90±5）%的干燥器中放置5 d。

经过破坏性处理的样品分别用流动相稀释至容量瓶标线，摇匀，过滤，在1.3 色谱条件下依次进样测定。图1 为阿比特龙样品色谱图。由图1 可知，阿比特龙色谱峰与样品中其它杂质色谱峰分离良好，杂质色谱峰不影响阿比特龙的含量测定，该法专属性较强。试验结果表明：阿比特龙在酸、碱、氧化、高温、光照、高湿条件下相对稳定，与主色谱峰相比，其降解杂质可以忽略。

图1 阿比特龙样品色谱图

2.4 线性范围

将阿比特龙标准样品储备液用乙腈–水（7∶3）稀释，分别配制质量浓度为40～520 μg／mL 的系列标准工作溶液，在1.3色谱条件下，依次进样测定，每份溶液重复测定3 次，记录并计算色谱峰面积平均值。以溶液的质量浓度为横坐标、色谱峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得线性方程为A=31.957 2c+136.165 2，相关系数为0.999 7，表明阿比特龙的质量浓度在40～520 μg／mL 范围内与色谱峰面积线性关系良好。

2.5 检出限与定量限

用乙腈–水（7∶3）将40 μg／mL 的阿比特龙标准溶液逐级稀释后进样分析，分别以信噪比（S／N）3 和10 计算，阿比特龙的检出限和定量限分别为0.24，1.2 μg／mL。

2.6 精密度试验

分别称量6 份阿比特龙样品，按照1.2 方法配制成样品溶液，按1.3 色谱条件进样测定，测定结果列于表1。由表1 可知，测定值的相对标准偏差为0.27%，表明本方法精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.7 标准样品测定

精密量取阿比特龙标准样品储备液4.0，5.0，6.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用乙腈–水（7∶3）稀释至标线，制成320，400，480 μg／mL 的溶液(对应于样品溶液浓度的80%，100%，120%），每种溶液平行制备3 份，按1.3 色谱条件进行分析，计算回收率，结果列于表2。由表2 可知：阿比特龙回收率为99.12%～99.88%，符合《中国药典》（2015 版）的规定。