牦牛德尔卑沙门氏菌的分离、鉴定及致病性研究

冯 兰，安添午，崔鹏飞，赵晓东，李华德，付 雪，张 兰，翟亚如，李 豪，晏文俊，王红宁，杨 鑫

(1. 四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610065； 2. 四川省草原科学研究院，成都 610097)

1 引 言

牦牛是生活在高海拔地区的哺乳动物，主要分布在中国、俄罗斯、尼泊尔和蒙古.牦牛全球总数约1 420万头，95%生活在中国，其中四川省阿坝藏族自治州牦牛存栏量约为152万头.由于高原地区独特的生境，且不同高原物种共享同一生态资源，致使病原菌的种间传播风险更高，牦牛更易感染各类疾病[2].其中，腹泻是导致牦牛高死亡率的主要因素[3].

沙门氏菌是一种严重危害动物和人类健康的病原菌，在人类[5]、猪[6]、鸡[7]、牛[8]、骆驼[9]、羊[10]等中均曾有过沙门氏菌病爆发的记录.自1885年首次被分离出来，沙门氏菌血清型已发展到2 637种[11].部分血清型仅能感染一种或两种特定宿主，例如鸡白痢沙门氏菌仅以鸡为宿主[12]，德尔卑沙门氏菌多以猪，鸡以及人类为宿主[13].其余大部分血清型沙门氏菌具有广泛的感染对象.在中国，流行的沙门氏菌血清型众多，包括鼠伤寒沙门氏菌[14]、副伤寒沙门氏菌[15]、肠炎沙门氏菌[16]、及德尔卑沙门氏菌[17]等.在中国四川西部及青藏高原等特殊生境，沙门氏菌也有着较长的流行历史.自1958年甘肃牧区马场爆发沙门氏菌病以来[18]，有关沙门氏菌感染藏系物种的报道越来越多，其中牦牛沙门氏菌尤甚.调查发现，感染牦牛的沙门氏菌以都柏林沙门氏菌、病牛沙门氏菌以及纽波特沙门氏菌为主.本研究首次从腹泻牦牛体内分离得到德尔卑沙门氏菌ST71，并研究了德尔卑沙门氏菌的致病性，对牦牛腹泻病的防控具有实际指导意义.

2 材料和方法

2.1 材 料

PBS(上海源叶生物科技有限公司)、三氯甲烷(成都华耀化工有限公司)、异丙醇(四川绿森林化工有限公司)、DEPC水(Biosharp)、75%乙醇、95%乙醇、TRIZol(Invitrogrn)、TAKARA反转录试剂盒(生产厂家)、Taq Master Mix(成都擎科生物科技有限公司)、DNA marker2000(成都擎科生物科技有限公司)、病毒引物(成都擎科梓熙生物技术有限公司)、BHI培养基(北京陆桥技术股份有限公司)、BPW培养基(北京陆桥技术股份有限公司)、MM培养基(北京陆桥技术股份有限公司)、M-H培养基(北京陆桥技术股份有限公司)、XLT4培养基(北京陆桥技术股份有限公司)、50%丙三醇(成都科龙化工试剂厂)、生理盐水、Taq Master Mix(成都擎科生物科技有限公司)、ddH2O、TR101沙门氏菌属诊断血清(宁波天润生物药业有限公司)、细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)、药敏纸片(杭州微生物制剂有限公司)、4～6周龄，体重18～20 g Balb/C雄性小鼠36只(四川大学动物实验中心)、生理盐水、50%动物组织固定液(成都里来生物科技有限公司)、超纯水、小鼠灭菌饲料(成都达硕实验动物有限公司).

2.2 方 法

2.2.1 样本采集 2017年，于四川省红原县龙日坝乡四所养殖场采集腹泻牦牛新鲜粪便16份.采用灭菌棉签取腹泻粪样5～6 g于10 mL Eppendorf灭菌试管中,进行编号整理后置于4 ℃冰箱冷藏保存，采样工作结束后48 h内带回四川省动物疫病防控与食品安全重点实验室开展后续实验.

2.2.2 病毒PCR检测 所有样本均进行牛腹泻相关病毒的检测，共计检测7种病毒：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛圆环病毒(BToV)、牛轮状病毒(BRV)、牛星形病毒(BAstV)和牛诺如病毒(BNoV)，引物序列如表1所示.

2.2.3 细菌的分离鉴定 取粪样1 g于5 mL PBS中振荡混匀，使用缓冲蛋白胨水(BPW，8～18 h，37 ℃，180 r/min)和Rappaport's肉汤(MM，18～24 h，37 ℃，180 r/min)对样品进行预富集，于XLT4选择性培养基(37 ℃，24 h)初筛，分离菌革兰氏染色镜检.随后用BD-Phoenix-100系统(bekton-Dickinson)对分离的菌株进行全物种鉴定，并用16S rDNA引物27F和1492R (27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR鉴定.PCR产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序.利用NCBI数据库，采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)对PCR产物的测序结果进行分析.

表1 牛腹泻相关病毒引物Tab.1 Primer sequences of bovine diarrhea viral

2.2.4 药物敏感性实验 采用纸片扩散法测定菌株的耐药表型，并根据抗菌药物敏感性试验执行标准; 第二十三版资料增刊(CLSI)的要求，在Mueller-Hinton琼脂平板上对19种抗生素进行检测：氯霉素(C；30 μg)、四环素(TE；30 μg)、头孢噻呋(EFT；30 μg)、阿莫西林(AMC；30 μg)、氨苄西林(AMP；10 μg)、头孢他啶(CAZ；30 μg)、复方新诺明(SXT；1.25+23.75 μg)、环丙沙星(CIP；5 μg)、头孢曲松(CRO；30 μg)、氟苯尼考(FFC；30 μg)、亚胺培南(IPM；10 μg)、诺氟沙星(NOR；10 μg)、多西环素(DO；30 μg)、阿米卡星(AMK；30 μg)、氨曲南(ATM；30 μg)、多粘菌素(PB；300 units)、庆大霉素(CN；10 μg)、磷霉素(FOS；200 μg)、替加环素(TGC；15 μg).根据CLSI推荐的临床解释标准对结果进行判读，多粘菌素和替加环素采用欧洲抗菌药物敏感试验委员会关于抗菌药物敏感试验的技术说明进行结果判读.

2.2.5 多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST) 采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取沙门氏菌DNA，对沙门氏菌的7对管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA)进行PCR扩增，引物序列以及扩增片段大小如表2所示.PCR产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司对扩增产物进行测序.使用Enterobase(http://enterobase.warwick.ac.uk/)对序列进行分析并得到最终分型结果.

表2 沙门氏菌管家基因引物序列Tab.2 Primer sequence of housekeeping gene of Salmonella

2.2.6 血清型鉴定 沙门氏菌血清型鉴定采用宁波天润 TR101沙门氏菌属诊断血清(60种)试剂盒.选择洁净消毒的载玻片作为血清凝集反应发生载体，并选取干净黑色桌面作为背景以便于清晰观察.随后进行血清凝集，观察凝集情况，于1 min内观察其是否出现明显凝集现象并逐一记录.

2.2.7 小鼠致病性实验 4～6周龄，体重18～20 g Balb/C雄性小鼠36只购于成都达硕实验动物有限公司，将小鼠置于25±2 ℃的温度下，在12 h的光/暗循环下进行为期7 d的驯化.通过构建沙门氏菌OD600与活菌数量线性回归方程，计算37 ℃ 160 r/min恒温摇床过夜培养的沙门氏菌浓度，并逐步梯度稀释至105～109CFU/mL备用.将驯化良好的小鼠随机分为6组，6只/组(编号A-F)，选取分离株15XLR进行动物实验，A组小鼠腹腔注射生理盐水0.2 mL(0.2 mL/10 g)作为阴性对照，B-F组依次注射0.2 mL浓度为105～109CFU/mL沙门氏菌菌液.每日监测其健康状况，连续监测7日，观察是否出现典型腹泻症状(精神不适，进行性虚弱、厌食、低头和腹泻).本实验采用Reed-Muench法计算牦牛德尔卑沙门氏菌LD50值.计算方法如下:

距离比例=(高于50%的死亡率-50%)/(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)

lgLD50=高于50%死亡率细菌稀释度的对数+距离比例 稀释倍数的对数

对死亡小鼠立即解剖，取肺脏，脾脏，肝脏，回肠，盲肠，结肠各3 g于5 mL PBS中洗涤后保存于动物组织固定液中，由成都里来生物公司进行病理切片制作.

3 结 果

3.1 细菌的分离与鉴定

经检测，所有样本中，被检测7种病毒均为阴性，表明本次牦牛腹泻并非由病毒感染导致.自XLT4选择性培养基分离到菌落.菌落整体较为湿润且具有良好的光泽度形态呈黑色湿润圆状，直径较小，约1～2 mm.随后的BD-Phoenix-100系统和16S-PCR结果表明，从XLT4培养基中分离出的16株菌株均为沙门氏菌.

3.2 沙门氏菌多位点序列分型及血清型鉴定

Enterobase数据分析结果显示，16株沙门氏菌的7对管家基因等位基因序号均为：thrA:36、purE:29、sucA:9、hisD:36、aroC:39、hemD:8、dnaN:35.MLST型均为ST71.MLST分型结果相同表示分离菌属于相同的克隆.对分离得到的16株沙门氏菌进行血清凝集反应，试验结果表明，所有被检测沙门氏菌均为德尔卑沙门氏菌(S.Derby)(([1]，4，[5]，12: f，g: [1,2])).

3.3 药物敏感性实验

药敏试验结果显示所有分离株均对阿莫西林、头孢他啶、磺胺甲恶唑、环丙沙星、头孢曲松、氟苯尼考、亚胺培南、诺氟沙星、强力霉素、阿米卡星、氨曲南、多粘菌素、庆大霉素、磷霉素、替加环素敏感，同时对四环素、氨苄西林、氯霉素和头孢噻呋4种抗生素多重耐药(表3).

表3 牦牛沙门氏菌分离株药物敏感试验结果Tab.3 Antimicrobial susceptibility patterns for 16Salmonella isolates from yaks with diarrhea in Hongyuan，Tibetan Qiang Autonomous Prefecture of Ngawa，China

3.4 小鼠致病性实验

3.4.1 半致死剂量测定 由于菌株源自相同克隆，本研究选取腹泻最为严重粪样15XLR分离株开展动物实验.通过计算动物存活率，沙门氏菌15XLR在Balb/C小鼠体内的致病性进行了测定.结果表明，分离的德尔卑沙门氏菌15XLR在106CFU/mL时具有致死能力，在109CFU/mL时致死率为100%(表4)，根据Reed-Muench法，计算得到半致死剂量(LD50)为1.2×107CFU.

表4 不同剂量德尔卑沙门氏菌对小鼠致死情况Tab.4 The statistics of death mice by different dose of S. Derby

3.4.2 病理切片观察 苏木精-伊红(HE)染色结果显示小鼠脾白髓内有散在的小坏死灶.淋巴细胞明显凋亡或坏死，有核溶解或碎裂现象，细胞肿胀和解体，实质淋巴细胞数量明显减少，红髓面积比例相对增加.肠道组织内可见大量病变，肠结构被严重破坏.肠粘膜细胞有明显增生，肠粘膜严重局灶性坏死.细胞解体，坏死区周围可见少量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，肠腺萎缩.肠黏膜局灶性坏死，炎性细胞浸润等病理变化提示受试小鼠免疫功能和消化功能下降(图1).

4 讨 论

牦牛沙门氏菌病在牧区长期流行，有关该病的报道最早可追溯到1958年在甘肃山丹马场爆发过的沙门氏菌病，引起严重的牛群死亡，尤以感染犊牛为甚[18].牧区流行的沙门氏菌血清型主要为都柏林沙门氏菌与病牛沙门氏菌.对四川的调查研究显示，腹泻耗牛粪便中主要以都柏林沙门氏菌为主.2011年，朱晓霞等[21]从四川省青藏高原临床健康耗牛新鲜粪便中分离到31株沙门氏菌，血清型鉴定分别为：御成门沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、布利丹沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、奥雷翁沙门氏菌和纽波特沙门氏菌.2016年孔雪英等人[22]于红原县，小金县以及理县总共分离得到33株沙门氏菌，鉴定血清为乙型副伤寒沙门氏菌(S.ParatyphiB)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis)，丙型副伤寒沙门氏菌(S.ParatyphiC)以及汤卜逊沙门氏菌(S.Thompson).未见德尔卑沙门氏菌感染牦牛的研究报道.

德尔卑沙门氏菌MLST型主要为ST39、ST40、ST71以及ST368[23]，蔡银强的研究报告指出，德尔卑沙门氏菌ST40可对至少三种抗生素，特别对四环素的耐药表型.相比ST40，ST71则为易感菌株.在2019年Sévellec 等的调查报告中表明[25]，143株菌株中有35.7%表现出耐药表型，其中对磺胺甲恶唑和四环素的耐药率较高(>70%)，对氟喹诺酮的耐药率在英国和西班牙分离的德比沙门菌中均有发现.该研究进一步研究发现，ST71极容易产生对氨基糖苷类、磺胺类和四环素类抗生素的耐药性.与Sévellec 等的研究不同，本研究中，ST71菌株对氯霉素(C)、头孢噻呋(EFT)、氨苄西林(AMP)和四环素(TE)四种抗生素均有多重耐药，分别属于广谱抗生素、头孢菌素和青霉素类.藏区牦牛沙门氏菌耐药谱变化，提示牧区应注意抗生素尤其是广谱抗生素的使用，应联合用药，以避免单一用药造成超级耐药沙门氏菌的出现.本研究沙门氏菌半致死剂量为1.2×107CFU，与其他血清型沙门氏菌半致死剂量，如与Tennant等[26]等研究的都柏林沙门氏菌(2×104CFU)和斯坦利维尔沙门氏菌(9.1×104CFU)相比，德尔卑沙门氏菌非强毒力菌株，但仍可在一定浓度范围内具有致病及致死能力.