鱼源致病性类志贺邻单胞菌的研究进展

陈美群，王冬平，潘瑛子，张 驰，扎西拉姆，田 云

( 1.西藏自治区农牧科学院 水产科学研究所，西藏 拉萨 850032； 2.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128 )

类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)为肠杆菌科、邻单胞菌属内唯一种[1]，广泛分布于自然界，是一种全球性分布细菌，水生态环境是其主要储存地，而鱼类是其常见宿主，可通过受污染的水、鱼及贝类感染人类[2-6]。类志贺邻单胞菌是一种人—兽—鱼共患病原菌[7]，可导致鱼类等水产动物疾病频发，同时也可引起人类的肠胃炎、败血症、脑膜炎、腹泻和食物中毒等疾病[8-10]，因此受到国内外学者的广泛关注。

1 分类和命名

类志贺邻单胞菌最早由Ferguson等[11]于1947年从一位肠胃炎患者粪便中分离得到，被标志为C27副大肠菌，属肠杆菌科。1957年根据其有端生鞭毛的特征将其归入假单胞菌属(Pseudomonas)，改称为类志贺假单胞菌(Pseudomonasshigelloides)[12]。1962年Habs等研究发现，此菌在厌氧条件下能发酵葡萄糖，形态上并不严格呈逗点状、端生鞭毛，不产明胶酶、蛋白酶、脱氧核糖核酸酶等胞外酶的特性，将其归为弧菌科的一个新属(即邻单胞菌属)，由于该菌与宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)Ⅰ型有共同抗原，故命名为类志贺邻单胞菌[13]。该菌曾长期被划归到弧菌科，后随着脱氧核糖核酸杂交、全基因组序列分析等多相分类鉴定技术的发展，在2005年第二版《伯吉氏系统细菌学手册》中，又将类志贺邻单胞菌确立为肠杆菌科，邻单胞菌属的唯一种[1]。

2 生物学特性

2.1 形态特征

类志贺邻单胞菌为革兰氏阴性杆菌，菌株为末端圆形直杆状，无芽胞，荚膜或有或无[14-15]，大小通常为(0.8～1.0) μm×3.0 μm[15]，呈单、双或短链状排布，丛生鞭毛或单生鞭毛[13-15]。该菌在营养琼脂平板上生长良好，菌落呈圆形、微隆起、表面湿润光滑，边缘整齐，不同来源的菌株在营养琼脂上菌落颜色有差异，异育银鲫来源的菌株菌落呈灰白色半透明状菌落[15]，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)来源的菌株菌落呈米黄色半透明状[16]，黑莓鲈(Pomoxisnigromacufastus)来源的菌株菌落呈淡黄色不透明[17]；在血琼脂上菌落呈灰白色，一般无溶血现象[15]，偶有微溶血现象[16]；在麦康凯琼脂菌落呈无色透明[15]；在沙门氏菌(Salmonella)—志贺氏菌琼脂培养基(SS琼脂)上呈无色、圆形、半透明状的小菌落，中心呈桔黄色[15]；在脑心浸出液琼脂培养基上菌落呈圆形、米黄色不透明，表面光滑湿润、微隆起、边缘整齐[2]；在TSA琼脂培养基上菌落圆形、白色不透明、表面湿润、中间凸起、边缘整齐[5]；在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)培养基上不能生长[13]。不同来源的菌株或培养条件的差异都有可能会导致其细胞和菌落形态、鞭毛数目及着生情况发生变化[15]。

2.2 培养特性

类志贺邻单胞菌为兼性厌氧菌，温度、pH、氯化钠含量对该菌的生长均有影响。Miller等[18]研究表明，类志贺邻单胞菌对温度、pH、盐度的适应范围较广，在温度8～45 ℃、pH 4.0～9.0的条件下均可生长，耐受盐度20.0～30.0，对营养要求较低。陈林等[14]研究斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)来源的类志贺邻单胞菌的最适生长条件，发现在不添加氯化钠的普通营养肉汤培养基(pH 7.03)中，37 ℃时生长速度最快；盐度为0～2.5的普通营养肉汤中均可生长，其中在盐度1.5～2.0时生长最好；在pH为5～10的普通营养肉汤(含氯化钠0.5 g)中均可生长，其中以pH 6.5～8.0时生长最好。 刘志刚等[19]对罗非鱼来源的类志贺邻单胞菌研究表明，该菌株在温度25～37 ℃、pH 5.0～8.0和盐度0～11内生长良好，其最适生长条件为温度37 ℃、pH 8.0和盐度5。

2.3 主要生理生化特性

关于类志贺邻单胞菌生理生化特征的研究较多，综合相关研究总结类志贺邻单胞菌主要生化特征为：氧化酶阳性，能分解发酵葡萄糖产酸不产气，硝酸盐还原、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶阳性。产吲哚，不产脂酶、色氨酸脱氨酶，明胶液化、V-P试验、硫化氢等指标阴性(表1)，不同来源菌株间生化特征略有差异[5,14-17,19-21]。

表1 类志贺邻单胞菌主要生理生化特征

2.4 血清型特征

1959年Sakazaki等[22]首先分析了类志贺邻单胞菌的血清学分型，将22株类志贺邻单胞菌分为5种菌体(O)抗原和4种鞭毛(H)抗原。1978年Shimada等[23]对87株类志贺邻单胞菌进行了血清学研究，发现了30个O抗原和11个H抗原，后续研究又将类志贺邻单胞菌血清型发展到50种O抗原(O1～50)和17种H抗原[24]。1988年杨正时等[25]新发现了5种新的O 抗原(Oy51～Oy55)。2000年Aldová等[26]将类志贺邻单胞菌血清学分型分为102种O抗原和51种H抗原。目前，我国对鱼类来源的类志贺邻单胞菌血清学分型研究较少，王宇等[27]将从郑州集贸市场161份食用淡水鱼类样品中检出的18株类志贺邻单胞菌分为O3、O5、O15、O19、O27、O49等6种血清型。刘永大等[28]从抚顺地区市售淡水鱼中分离到123株类志贺邻单胞菌分为21个血清型。梁玉裕等[29]对广西地区类志贺邻单胞菌调查研究发现自人体检出的11株类志贺邻单胞菌分属于O1、O4、O8、O13、O15、O35、O43等7种血清型，同时这些血清型从鱼类或水体中均能检出，说明人源菌株与鱼类携带菌株有着密切联系，类志贺邻单胞菌可通过被污染的鱼或水体而感染人类。

3 流行规律及致病特征

类志贺邻单胞菌是一种条件致病菌，一旦环境适宜就会发生作用，发病后可对鱼类等水产动物造成极大危害，其感染死亡率高达60%～100%[14-15,21]。类志贺邻单胞菌的适宜水温为25～37 ℃，每年夏秋季(4—8月)为鱼类疫情高发期[2,14,19]，并可通过被该病原菌污染的水体快速传播，导致该病原菌的大范围流行[14,20]。同时，该菌对温度、pH、盐度和营养的适应范围较广，使其在各种水体和不同季节均能存活[19]，笔者从西藏拉萨国家农业科技园区水产养殖基地(水温12 ℃)人工驯养的患病西藏裂腹鱼(Schizothoraxwaltoni)中也分离到该菌[30]。大规模集约化养殖的鱼类更易感染类志贺邻单胞菌[2,31]，尤其是在成鱼个体中，对鱼苗也有一定的影响。携菌鱼类发病时出现急性大面积暴发和死亡的现象比较少，患病鱼类从发病到死亡时间一般约 1～7 d[20]，部分鱼类从感染类志贺邻单胞菌到发病死亡可持续一个月之久[16]。

近年来，有关类志贺邻单胞菌对鱼类致病性的研究报道逐渐增多，该菌对不同鱼类的致病症状稍有差异(表2)，这可能是由于鱼种和养殖环境以及菌株差异所致。鱼类感染初期主要表现为轻微浮头和游动无力，反应迟钝并伴有摄食减少的现象[20]。随着感染程度的增加，鱼类体表出现溃烂出血、肝脏肿胀并有出血点、鱼鳍溃烂出血、腹腔有腹水、肛门红肿有时伴有分泌物流出、胆囊和脾脏也有不同程度的肿大等症状(表2)。目前，关于鱼源类志贺邻单胞菌的致病机理研究较少。Ciznár等[32]通过分析不同来源的类志贺邻单胞菌，明确该菌只产生低水平的弹性蛋白水解酶、蛋白酶和组氨酸脱羧酶，而三酰甘油脂肪酶活性相对较高，其毒力因子可能与菌的表面性质主要是疏水性、鞭毛运动、组氨酸脱羧酶、三酰甘油脂肪酶和溶血性等相关。Tsugawa等[33]对类志贺邻单胞菌细胞毒性外膜蛋白(ComP)的基本结构和功能研究表明，ComP可能是引起感染后宿主细胞死亡的主要毒力因子。陈林等[14]从患病斑点叉尾来源的类志贺邻单胞菌中也检测到ComP基因，该基因编码的蛋白质具有一定的致病力。Ekundayo等[34]采用比较基因组学发现，邻单胞菌属菌株的开放阅读框(ORFs)与其他病原体中鉴定的毒力基因同源或直系同源，证实了类志贺邻单胞菌具有致病能力，可能具有与肠外感染相关的毒力因子(VFs)。张明洋等[35]指出类志贺邻单胞菌的毒力因子除类霍乱毒素、细胞毒素和溶血素外，还发现有2种热稳定性不同的肠毒素：类志贺邻单胞菌的外毒素及菌体裂解释放的内毒素，可造成严重的组织损伤，这可能是该菌引起消化道病变的主要原因之一。刘志刚等[19]研究表明，类志贺邻单胞菌感染尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)后，导致鱼肠组织中肠绒毛膜上皮细胞脱落，局部淋巴细胞浸润，黏膜上皮中杯状细胞肿胀及数量增多；部分肝细胞坏死，细胞核溶解，大量肝细胞出现空泡化；脾脏组织中淋巴细胞增多，多点出血；肾脏组织中肾小管管壁细胞裂解，肾小管结构被破坏；心肌细胞变大，细胞核增大，染色加深等。类志贺邻单胞菌对鱼类危害较大，有必要进一步开展其致病机理方面的研究。

表2 类志贺邻单胞菌的主要鱼类来源及其致病特征

(续表2)

4 药敏特性及防治措施

有关类志贺邻单胞菌药敏特性及毒力因子的研究报道较多，龙苏等[16]研究发现，黄颡鱼致病性类志贺邻单胞菌对先锋Ⅵ、恩诺沙星、环丙沙星、先锋必、氟苯尼考等16 种药物都高度敏感，对青霉素G和氨苄青霉素具有较强的耐药性。刘志刚等[19]对尼罗罗非鱼致病性类志贺邻单胞菌的药敏结果表明，该菌已呈现多重耐药性，仅对头孢曲松、头孢唑啉等7种抗生素敏感。张效平等[5]发现，江鳕源类志贺邻单胞菌对头孢曲松、先锋Ⅵ、卡那青霉素、庆大霉素等呈现多重耐药特征，但对四环素、氧氟沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、复方新诺明等13种药物较敏感。杨虹等[45]对分离自广东省不同地区的患病鳜鱼(Sinipercachuatsi)、大口黑鲈(Micropterussalmoides)和乌鳢(Channaargus)的55株类志贺邻单胞菌研究表明，上述类志贺邻单胞菌对克林霉素、万古霉素、氨苄西林、麦迪霉素、羧苄西林、苯唑西林的耐药性较高，TEM、gyrB和tetR等耐药基因检出率分别为18.2%、67.3%和36.4%，其中39株致病菌至少含有1种耐药基因。2018年Hossam等[46]首次报道了自1尾患病鲇鱼中分离到的多重耐药类志贺邻单胞菌菌株MS-17-188的完整基因组序列，这对于研究该菌株耐药的分子机制具有重要意义。Martins等[47]描述了从罗非鱼中分离到1株耐四环素的类志贺邻单胞菌FM82菌株的基因组草图序列，该菌株携带有抗菌素耐药性、生物膜和CRISPR相关基因。Martins等[48]报道，从巴西里约热内卢州的天然池塘鱼体中分离到耐药性较强的类志贺邻单胞菌，其中大部分类志贺邻单胞菌对四环素具有耐药性，小部分对氯霉素耐药，且这些耐药类志贺邻单胞菌均有耐四环素或氯霉素的耐药基因。邹升等[43]从环洞庭湖区患病草鱼肠道中分离得到类志贺邻单胞菌，该菌对红霉素、多黏菌素、利福平、万古霉素、氨苄西林、庆大霉素和卡那霉素产生较高的耐药性，并检测到S-核糖基高半胱氨酸酶和黏附素等毒力因子。豆朋朋等[44]对分离自患病黄颡鱼的类志贺邻单胞菌菌株L-1研究表明，该菌株对头孢哌酮、庆大霉素等敏感，对四环素中度敏感，对苯唑西林、氨苄西林等耐药。同时，该菌株检出Sul2、TEM、ant(3″)-Ⅰa和aac(6′)-Ⅰb等4种耐药基因。上述研究表明，不同菌株间的药敏特性及耐药特征具有一定差异，这些差异可能与菌株所处环境、宿主来源、抗生素环境等因素有关。

抗生素等药物的广泛使用可诱导类志贺邻单胞菌产生耐药性，同时耐药基因水平扩散或垂直传播亦可导致该菌耐药性增强，加大了该菌的防控难度[45]，所以近年来针对类志贺邻单胞菌的新防控措施逐渐增多。赖晓健等[38]对太平洋双色鳗鲡来源的类志贺邻单胞菌研究表明，五倍子、丁香和生地榆等中药提取物对该菌株具有较好的抑菌效果。李赫等[49]利用16种中草药提取物对类志贺邻单胞菌的体外抑菌研究显示，丁香对类志贺邻单胞菌的抑菌效果最好，其最小抑菌质量浓度(MIC)为31.25 mg/mL，黄芪次之，其最小抑菌质量浓度为62.5 mg/mL。Nisha等[50]从发酵大米中分离到一株假单胞菌BPH2益生菌，BPH2对类志贺邻单胞菌具有很强的抑制作用，该益生菌可有效地应用于水、土壤等养殖系统中，控制鱼类的细菌性病害。Gong等[51]从土壤中分离到一株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)SL001，其对类志贺邻单胞菌具有较强的抑菌作用，该菌可提高草鱼的免疫力并提高其生长速度。益生菌资源的挖掘与利用将是今后一段时期控制水产养殖病害的重要手段，有利于减缓病原菌的耐药性变异，提高病原菌的防控效果，促进水产养殖业健康发展。

5 展 望

目前，对从急性腹泻、食物中毒的患病人群中分离的类志贺邻单胞菌的致病机理的研究相对较多，但对从病鱼中来源的类志贺邻单胞菌的致病机理的研究较少。由于近年来由该菌引起的养殖鱼类患病较为频繁[52]，且对水产养殖业造成较大损失，因此有必要对鱼源致病性类志贺邻单胞菌的分子分型、致病机理和防控措施等进行深入研究，这对明确该菌对鱼类的致病性并控制其传播及流行具有重要的意义。在水产养殖中，抗生素经常被用来控制由细菌引起的传染病，但是抗生素的大量使用和长期反复使用容易造成细菌产生耐药性[53]，还会对水产养殖产品和环境造成药物残留问题，为此积极开发早期预防疫苗、快速诊断试剂盒、非抗生素新型药物等都具有广阔前景。此外极有必要开展拮抗菌等新型防治措施研究，分析拮抗菌的次级代谢产物及其对类志贺邻单胞菌的抑菌活性，以期找到对该菌具有较好抑制作用的新型活性物质[54]，为传统鱼类抗生素药物的替代提供研究基础。