盐度胁迫对方斑东风螺免疫酶活性的影响

谭春明，赵 旺，吴开畅，温为庚，杨 蕊，陈 旭，于 刚

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所，热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018； 2.农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300 )

方斑东风螺(Babyloniaareolata)属软体动物门、腹足纲、蛾螺科，俗称花螺、海猪螺和南风螺，分布于中国东南地区、东南亚及日本沿海等，是中国东南沿海主要的经济贝类。方斑东风螺肉质鲜美、营养丰富，是一种畅销且具有推广前景的优质海水养殖贝类[1]。近年来，方斑东风螺的养殖业在广东、广西和海南等沿海地区发展较快。但在养殖过程中，常因盐度波动造成方斑东风螺不摄食、生长慢、不繁殖，影响方斑东风螺的耗氧率和排氨率，甚至出现大量死亡等现象[2-3]。

影响方斑东风螺养殖的关键指标是早期发育阶段的摄食行为和活动状况，而摄食能力又受温度、水体质量及光照等环境因子影响[4-5]。盐度作为水产养殖中重要的水体环境指标之一，与养殖动物的渗透压、生长、发育关系密切[6]。在不同盐度下，水生动物的生长、成活率、能量代谢酶、非特异性免疫及生化成分均表现出明显差异[7-8]。海水盐度直接影响水生生物体内的渗透压，而渗透压调节主要由鳃和皮肤消耗能量从外界环境主动吸收或排除Na+和Cl-而实现，该能量调节过程使体内生化成分及免疫、消化相关酶活性发生改变，影响水生动物的存活、生长、代谢和繁殖[9-10]。刘珊等[11]指出，盐度的改变会影响水生生物体内血浆渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性，盐度突变后，各处理组的血液渗透压和鳃丝Na+/K+-ATP酶活性均随盐度的变化而上升或下降，其变化幅度与盐度的变化幅度相关。Chen等[12]在研究不同盐度条件下中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)幼虾耗氧量和氨氮排泄量的变化时发现，盐度是影响虾类呼吸代谢的主要因子之一，在最适盐度时体内外渗透压处于平衡状态，不需要消耗过多能量保持体内的环境稳定。盐度变化会导致水体无机离子含量发生变化，影响机体酶活力[13-14]。在水产养殖过程中，适宜的水体盐度和合理的盐度调节模式，不仅能降低水产动物病害暴发频率，而且能指导海水动物低盐度养殖及人工育苗[15]。

目前，盐度对水产养殖动物的影响研究主要集中在生长发育方面，包括鱼、虾、蟹及文蛤(Meretrixmeretrix)、九孔鲍(Haliotisdiversicolor)、虾夷马粪海胆(Strongylocentrotusintermedius)等动物，而有关盐度胁迫对贝类机体免疫相关酶活力影响的研究几乎处于空白。笔者研究方斑东风螺在不同盐度条件下其体内6种常见免疫酶过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶活力及行为活动，阐明盐度对其生理生化的影响及体内免疫酶应对急性胁迫时的调节规律，为提高方斑东风螺养殖效益，丰富贝类养殖生态学理论提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

方斑东风螺60日龄，平均体质量(0.386±0.080) g，壳长(0.65±0.15) cm，由南海水产研究所热带水产研究开发中心(海南，陵水)提供，原地进行试验。试验前，方斑东风螺暂养2 d，水质参数：温度(26.0±1.0) ℃，盐度33±0.8，溶解氧>6.5 mg/L，pH 8.0±0.2，亚硝态氮<0.04 mg/L，氨氮<0.01 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

利用海水与淡水或海盐分别调配成5、10、15、20、25、30、35、40、45和50共10个盐度梯度的养殖用水，放入健康状况良好、大小均一的方斑东风螺，观察其摄食行为、活动及存活状况，计算24、96 h 100%死亡质量浓度(24 h LC100和96 h LC100)，并以此设置各试验组的盐度。

设置18、23、28、33(对照组)、38共5个试验盐度，每个盐度设3个平行，每个试验容器(4 L，方形，蓝色，溶解氧6.8～7.0 mg/L)内投放30只健康良好的方斑东风螺，分别于6、12、24、36、48、72、96 h自各养殖桶中随机取样3只测定其免疫酶活力。每隔3 h自每个容器中取水样100 mL，严格控制各水质指标在设定范围内，及时调整发生变化的指标。日换水2次，每次换水50%，每24 h投喂一定量冰鲜鱼，除去养殖桶中的排泄物、剩余饵料及死去的方斑东风螺。间隔观察并记录各试验组方斑东风螺的摄食、活动状况、中毒症状以及死亡率。方斑东风螺置于塑料板上无明显活动迹象，用解剖刀触碰无反应即判断为死亡。

1.2.2 样品处理

用0.2 mol/L生理盐水将各试验组样品按1∶2(m/V)比例研磨。研磨液于5000 r/min、4 ℃下离心10 min，取1 mL上清液于洁净EP管中，置于冰箱-80 ℃保存待测。总蛋白含量及各酶活性用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.2.3 数据处理与分析

数据采用平均值±标准差表示，用SPSS 21.0进行统计分析。先对数据作单因素方差分析，若处理间有显著差异，再用Duncan法比较均值间的差异显著性(P<0.05)。为更好地呈现酶活的变化(诱导或抑制)，以处理组与对照组酶活性的百分比为数据作图，二者活性相等时定义为100%。

2 结 果

2.1 盐度胁迫对方斑东风螺行为及存活的影响

随着盐度在自然海水基础上的升高或降低，各盐度组方斑东风螺呈不同应激行为甚至死亡，主要表现为不活跃、运动缓慢，对外界刺激反应迟钝，爬壁运动减少，逐渐翻背，沉于水桶底部，身体僵硬直至死亡。死亡的方斑东风螺吻管向外凸出，螺肉外翻、惨白僵硬。盐度5、10、50处理组24 h内方斑东风螺便全部死亡，而盐度40组虽然100%存活但不活跃，运动迟缓，不爬壁，盐度15、20、25组有翻背现象，盐度30和35组基本良好，但长时间应激下呈现不活跃状况(表1)。由此可见，96 h的胁迫下方斑东风螺生长发育能适应的盐度范围较宽，但盐度低于15或高于40便出现超高死亡率。

表1 盐度胁迫对方斑东风螺行为及存活率的影响

2.2 盐度胁迫对方斑东风螺过氧化氢酶活性的影响

盐度胁迫时间对方斑东风螺的过氧化氢酶活性影响极显著(P<0.01)，不同盐度胁迫各组间个体过氧化氢酶活性变化同样存在显著差异(P<0.05)(图1)。低盐度处理6 h时方斑东风螺个体过氧化氢酶活性显著低于对照组，而高盐度组个体过氧化氢酶活性上升；随着盐度处理时间的延长，盐度18、23组方斑东风螺表现为“抑制—诱导”的变化趋势，而盐度28和38组却呈现“诱导—抑制—诱导”的趋势。

图1 盐度对方斑东风螺过氧化氢酶活性的影响

2.3 盐度胁迫对方斑东风螺酸性磷酸酶活性的影响

胁迫时间和不同盐度均显著影响方斑东风螺酸性磷酸酶活性(P<0.05)(图2)。盐度为18、38时，方斑东风螺酸性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，之后，随着处理时间不断增加，酸性磷酸酶活性呈现抑制趋势。盐度为23、28组个体酸性磷酸酶活性在轻微抑制之后随时间显著提高(P<0.05)，最终表现为酸性磷酸酶活性受抑制。可见，盐度胁迫对方斑东风螺酸性磷酸酶活性的影响总体呈“诱导—抑制”的变化趋势。

图2 盐度对方斑东风螺酸性磷酸酶活性的影响

2.4 盐度胁迫对方斑东风螺碱性磷酸酶活性的影响

盐度胁迫对方斑东风螺碱性磷酸酶活性的影响见图3。处理组个体碱性磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性的变化趋势几乎一致。不同盐度和处理时间对方斑东风螺处理组个体碱性磷酸酶活性影响显著(P<0.05)，盐度为18、38时，处理组方斑东风螺个体碱性磷酸酶的活性显著上升(P<0.05)，之后，随着处理时间不断增加，碱性磷酸酶活性呈现抑制趋势。盐度为23、28组碱性磷酸酶活性在轻微抑制之后随时间变化显著提高(P<0.05)，但最终表现为碱性磷酸酶活性受抑制。盐度胁迫对方斑东风螺个体碱性磷酸酶活性的影响总体表现出“诱导—抑制”的变化趋势。

图3 盐度对方斑东风螺碱性磷酸酶活性的影响

2.5 盐度胁迫对方斑东风螺总超氧化物歧化酶活性的影响

盐度胁迫对方斑东风螺总超氧化物歧化酶活性的影响见图4。处理时间对方斑东风螺总超氧化物歧化酶活性影响极显著(P<0.01)，不同盐度组个体总超氧化物歧化酶活性变化在短时间内不存在明显差异(P>0.05)。与对照组相比，高盐度处理组(38)对总超氧化物歧化酶活性的影响表现为“诱导—抑制—诱导”，而其他盐度组(18、23、28)随时间的变化均表现为“诱导—抑制”的趋势。虽然96 h时，处理组总超氧化物歧化酶活性有回升的趋势，但仍然无法回到正常盐度下的状态。

图4 盐度对方斑东风螺总超氧化物歧化酶活性的影响

2.6 盐度胁迫对方斑东风螺谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

盐度胁迫对方斑东风螺谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响见图5，盐度胁迫时间对方斑东风螺谷胱甘肽过氧化物酶活性影响极显著(P<0.01)，不同盐度胁迫对各组个体谷胱甘肽过氧化物酶活性变化趋势存在明显差异(P<0.05)。相比对照组，各盐度组方斑东风螺个体谷胱甘肽过氧化物酶活性均呈“抑制—诱导—抑制”的变化趋势，其中盐度28组个体谷胱甘肽过氧化物酶活性的峰值出现在12 h，其他各盐度个体谷胱甘肽过氧化物酶活性的峰值均在24 h。试验终止时，各处理组谷胱甘肽过氧化物酶活性均低于对照组，表现为抑制作用。

图5 盐度对方斑东风螺谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响

2.7 盐度胁迫对方斑东风螺过氧化物酶活性的影响

各处理时间对方斑东风螺过氧化物酶活性影响极显著(P<0.01)，不同盐度胁迫对各组个体过氧化物酶活性变化趋势存在显著差异(P<0.05)(图6)。相比对照组，盐度23、28处理组个体过氧化物酶活性先诱导后抑制；而盐度18、38组在24 h过氧化物酶活性显著高于对照组(P<0.05)，随时间的变化呈现“抑制—诱导—抑制”的变化趋势。试验终止时，除盐度28组略微上升外，其他各胁迫组个体过氧化物酶活性均显著低于对照组(P<0.05)。

图6 盐度对方斑东风螺过氧化物酶活性的影响

3 讨 论

3.1 盐度对方斑东风螺个体存活和活力的影响

本试验中，在盐度胁迫下方斑东风螺表现出一定的应激行为即中毒现象。耐盐性及存活率结果表明，方斑东风螺具有较强的抗逆性，但养殖用水盐度低于15或高于45便会出现超高死亡率。杨章武等[3]在研究盐度对方斑东风螺摄食与生长的影响时指出，方斑东风螺适宜盐度为21～33，下限为15，在非适宜盐度下方斑东风螺的摄食率和生长速度明显减低。这一耐受性还与方斑东风螺所处的发育阶段有关，稚螺期的盐度耐受性较胚胎期强。方斑东风螺胚胎发育时期的最适盐度为20～28，最低和最高临界盐度为14和32[16]。在养殖过程中应根据生长期尽可能控制养殖水体处在适宜的盐度范围。

3.2 盐度对方斑东风螺个体免疫酶活性的影响

研究表明，当海洋鱼贝类处在不适宜的盐度环境下时，其抵抗力、免疫力、食物消化吸收率和代谢率等会降低, 进而对生物体的生长和存活造成严重威胁，而贝类免疫力的下降甚至造成病害暴发[17-20]。盐度对鱼贝类等水生动物的影响主要和渗透压调节有关，而渗透压主要通过影响细胞膜的通透性[21]、激素的调节[22]、蛋白的表达[23]和离子通道表达[24]来改变个体生理功能，影响个体的生长发育。不少研究指出，渗透压影响水生动物的生化成分(蛋白质、脂肪酸、氨基酸等)、消化酶及免疫酶活性，进而影响其消化系统及免疫系统[7,10,25-27]。水生动物的免疫系统在应对不良环境的刺激时起主导作用，其中过氧化氢酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及谷胱甘肽过氧化物酶等在免疫调节过程中占重要地位[28-29]。本试验测定了盐度胁迫下方斑东风螺6种免疫酶的活性，结果表明，无论是胁迫时间还是胁迫剂量均显著影响免疫酶活性。与对照组相比，随着处理时间的变化，总体上过氧化氢酶活性表现出“诱导—抑制—诱导”的变化趋势，而谷胱甘肽过氧化物酶活性表现为“抑制—诱导—抑制”的变化趋势。这与盐度对条石鲷(Oplegnathusfasciatus)幼鱼[30]肝脏抗氧化酶活力的影响规律相一致，随着盐度升至38，总体上过氧化氢酶活性表现出“诱导—抑制—诱导”的趋势。抗氧化酶活性的提高可能是贝类在盐度胁迫环境下，活性氧自由基大量产生，机体处于过氧化状态，为保持抗氧化系统处在动态平衡而作出的一种反应。但是，当机体产生的活性氧量超过抗氧化系统的清除能力时，便会氧化损伤细胞结构，使抗氧化酶活性降低。另外，在非等渗环境中，需要消耗体内储存的能量来适应水体的盐度变化，该过程会导致机体消化酶及免疫酶活力发生变化[30-31]。本试验结果表明，方斑东风螺不同处理组的各免疫酶活性均随盐度的增加或时间的延长呈先升后降的变化趋势；低盐度对消化酶活力的影响大于高盐度。然而，方斑东风螺酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性随着胁迫时间的变化呈现出先诱导后抑制。这也支持了其他水生生物的研究结果。如陈宇锋等[32]发现锯缘青蟹(Scyllaserrata)超氧化物歧化酶活性随着盐度的增加先促进后抑制；宋晓楠等[33]在研究盐度变化对菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)体内抗氧化酶活力的影响时指出，在盐度25和盐度15胁迫下其体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性呈现“先显著升高后显著下降”的变化趋势；徐立红等[34]指出，受到轻度逆境胁迫时，诱导鱼体碱性磷酸酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等活性，而受重度逆境胁迫时，其活性则被抑制。这种现象可能是细胞代谢发生一定程度的改变所引起的而不是免疫应激的结果，生物体长时间在高盐度胁迫下，免疫体系不能及时清除其体内自由基，破坏了机体的氧化与抗氧化平衡，致使自由基在鱼体内累积，从而对细胞产生氧化损伤[34-35]。在一定程度上，免疫酶活性恢复正常水平的时间反映了机体对环境的适应能力。

各免疫酶活性随着盐度的变化虽然具有显著性，但并不存在明显的线性关系或一致规律，变化规律较特异，这可能与方斑东风螺的高抗逆性等生理习性或所处发育阶段不同有关，也可能是盐度胁迫对其免疫系统造成了一定紊乱效应，但胁迫处理剂量仍在其适应范围内。另外，试验对象规格不同、养殖密度不同以及溶解氧、饵料量等环境因子不同，同样可造成盐度胁迫程度的显著差异。

4 结 论

研究表明，方斑东风螺生长发育状态良好的盐度为20～35，当养殖用水盐度低于15或高于40便出现超高死亡率；相同高、低盐度条件下，胁迫时间越长，方斑东风螺死亡率也越高。不同盐度和处理时间均显著影响方斑东风螺免疫酶活力(P<0.05)，受到轻度逆境胁迫时，诱导方斑东风螺过氧化氢酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，而受重度逆境胁迫时，则抑制其活性。本试验警示，方斑东风螺及其他水生动物养殖过程中，应严格控制好水体中的盐度以防应激反应，以提高方斑东风螺养殖的存活率和促进其生长发育。