气滞血瘀型非小细胞肺癌患者肠道菌群-免疫功能的初步研究*

钱 祥 陈 卓 张爱琴#

1 中国科学院大学附属肿瘤医院 浙江 杭州 310022

2 中国科学院肿瘤与基础医学研究所 浙江 杭州 310022

3 浙江省肿瘤医院 浙江 杭州 310022

本文研究气滞血瘀型非小细胞肺癌肠道菌群与免疫功能的差异，旨在为充实中医理论的现代化研究供应新方法，这也将是疾病诊断和健康评估理念的新起点。

1 临床资料

1.1 研究对象：研究对象为2019年3月1日至2019年10月30日在中国科学院大学附属肿瘤医院胸部外科收治的经手术病理和/或穿刺活检术证实为非小细胞肺癌且符合本研究组纳入标准的患者，另设健康人群作为空白对照组。严格根据如下标准，最终纳入气血瘀滞组13例，健康对照组12例。

1.2 纳入标准：分述如下。

1.2.1 患者入组标准：年龄18～70周岁；参照中国临床肿瘤学会（CSCO）非小细胞肺癌诊疗指南（2018年版），经手术病理和/或穿刺活检术证实为非小细胞肺癌的患者；非其他部位肿瘤转移至肺部；中医辨证分型参照全国高等中医药院校规划教材（9版）《中医诊断学》及相关文献，辨证结果符合气血瘀滞证；患者本人及家属同意参与本项研究，并签署相关知情同意书。

1.2.2 正常人群入组标准：空白对照组为正常健康志愿者，年龄18～70周岁，无合并严重心脑血管类的病史；近期三大常规、生化指标、肿瘤标志物、心电图、超声、胸部X片等均正常；近期未使用任何抗生素、肠道菌群调节剂等药物；无吸烟史、酗酒史等不良嗜好；舌质淡红、舌苔薄白，脉象和缓有力。

1.3 排除标准：近5年内曾患有或合并其他恶性肿瘤，但已充分治疗并控制的扁平细胞癌、子宫颈的原位癌或皮肤基底细胞癌除外；合并脑血管疾病、心脏病、肝肾相关疾病等重大内科疾病者，或目前正在参与其他临床实验的患者；近1月内有使用抗生素、肠道菌群调节剂等药物的患者；患有痴呆、精神异常、智力低下等任何妨碍对知情同意书理解的患者；不符合气滞血瘀型中医证候辨证分型标准的患者。

1.4 退出标准：依从性差；患者自己要求终止试验；患者不依从临床研究的相关程序；中医证型发生改变。

1.5 中医辨证：气滞血瘀证辨证参照全国高等中医药院校规划教材（9版）《中医诊断学》及相关文献：咳嗽不畅，痛处固定，夜间加剧，拒按，面色紫黯，舌质紫黯、边尖有瘀斑，脉细涩或结代。

2 检测方法

2.1 试剂与仪器：生化培养箱（LRH-150），酶标仪（CMaxPlus），白介素-12（IL-12）试剂盒（MM-2449H1），γ-干扰素（IFN-γ）试剂盒（MM-0033H1），MiSeq Reagent Kit PE300 v3，Roche Light Cycler96，XiangYi H1650-W离心机，Vortex，NanpDrop，Invitrogen Qubit Spectrophotometer，MiSeq Benchtop Sequencer，DNA电泳槽，凝胶成像系统，磁力架，琼脂糖（电泳），TAE（电泳），Aglient SureCycler 8800 Thermal Cycler，80%乙醇（纯化），Miseq 2×300v3试剂盒，罗氏LightCycler 96 qPCR仪 ，KaPA library Quantification Kit，含Qiime分析软件的计算机。

2.2 检测方法：分述如下。

2.2.1 免疫相关因子检测：使用EDTA抗凝真空采血管收集符合本研究组所设标准的患者空腹外周血5ml，静置半小时后采用3000r/min离心分离血清，从冰箱中取出血清，室温复温平衡20min，用酶联免疫吸附法（PCR）检测血清中IL-12、IFN-γ的含量。①标准品和待测样本：将一定数目的酶标包被板置于框架上，分别设置空白对照孔、待测样本孔、标准品孔，并且记录下三组孔位置，将50μl标准品加入标准品孔中；将10μl待测样本加入待测样本孔中，然后再加入40μl样本稀释液；空白对照孔不加。②将100μl辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体分别加入待测样本孔和标准品孔中，空白对照孔不加。③温育：反应孔用封板膜封住，在37℃的恒温箱中温育1h。④洗板：除去液体，并在吸水纸上吸干，将洗涤液填满每个孔，静置1min后将洗涤液除去，继续用吸水纸拍干，上述步骤重复5遍。⑤显色：每孔先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，用平板混匀器混匀30s，37℃避光显色15min。⑥终止：拿出酶标板，将50μl终止液加入到每个孔中，终止反应。⑦测定：以空白对照孔调零，在终止反应后的15min内，用450nm的波长测量出各孔的吸光值。

2.2.2 肠道菌群检测：①粪便采集及DNA提取：与患者及正常健康志愿者充分沟通后，签署知情同意书。采集受试者自然排出至无菌容器内的新鲜粪便，迅速将粪便置于取样试管中，并1h内运至实验室进行样品前处理。称取200mg粪便样本，然后加入30ml缓冲溶液，置于震荡器上充分震荡混匀，高速离心机以1000rpm离心5min后收集沉淀。重复上述操作3次后沉淀以10ml缓冲液重悬，将重悬液按每管1ml分装后放置在－80℃度冰箱中。粪便微生物DNA使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit依照使用说明进行提取。待提取后，用琼脂糖凝胶电泳和Thermo Nano Drop 2000紫外微量分光光度计进行总DNA质检。②目标区域扩增：将样本进行16S V3-V4区域扩增，引物信息为：Forward primer：CCTACGGGNGGCWGCAG； Reverse primer：GACTACHVGGGTATCTAATCC。将稀释后的基因组DNA作为模板，使用Phanta Max Master Mix（Vazyme）高保真酶进行PCR，以保证扩增的准确和高效。PCR的反应条件是：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，重复25个循环；最后72℃持续5min。PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）25μl，引物（10μM）各为2μl，加入ddH2O至50μl。③产物质检：取1.5μlPCR产物（上一步骤所获取的），使用2%琼脂糖胶，置于120V电压下持续电泳20min后使用凝胶成像系统进行紫外成像拍照。④上机测序及生信分析：文库质检合格后，使用Qubit对混合文库pool进行浓度定量，并依据每个样品的数据量要求，进行相应的比例混合，最后运行Miseq测序程序。使用cutadapt软件将原始数据去引物，以确保数据是目标片段。用pandaseq软件将不含引物PE（paired-end）序列拼接成长tags，对拼接长tags进行质控。接着用vsearch软件对高质量长序列进行去除嵌合体。对去除嵌合体的高质量数据按相似度0.97进行OTU聚类，挑选代表序列，对代表序列进行物种注释。同时使用qiime流程得到OTU丰度表和物种丰度表。

2.3 统计学处理：肠道菌群的数据用SPSS 15（SPSS,Chicago,IL,USA）进行分析，用秩和检验方法进行组间显著性差异分析，采用R语言stats包的kruskal.test函数找出组间有明显差异(P＜0.05)的物种。免疫部分数据以均值±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。组间比较，方差齐性者采用两独立样本t检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis检验。

3 研究结果

3.1 患者基础资料：13名肺癌患者经病理诊断均为腺癌，男性7例，女性6例，平均年龄59.46±7.34岁。参照中国临床肿瘤学会（CSCO）非小细胞肺癌诊疗指南（2018年版）标准，所有患者中I期病例8例（61.5%），Ⅱ期病例5例（38.5%）。

3.2 OTU分析：分述如下。

3.2.1 OTU聚类及稀释曲线：α多样性分析是微生态中常用的方法，用来评估测序深度是否覆盖全面，反应样品内部物种的多样性，并绘制出相应的物种丰富度稀释曲线图。详见图1。从图中可以看出，随着reads条数的增加，曲线不断趋于平坦，说明本次使用的数据量是比较合理的。

图1 样品物种丰富度稀释曲线图

3.2.2 OTU韦恩图分析：16S测序分析结果显示，本研究中25个样品共产生了250个OTU。其中共有OTU 173个，气血瘀滞组有33个独有的OTU，健康对照组有44个独有的OUT，初步说明两组之间OTU具有一定的差异。

图2 OTU韦恩图

3.3 差异物种分析：图3显示属水平相对丰度前20的种系，其中有5个差异性菌属，分别是普氏菌属（Prevotella）、梭菌属（Clostridium XIVa）、毛螺菌属（Lachnospiracea）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、放线菌属（Actinomyces）。

图3 属水平差异性菌属柱状图

3.4 血清IL-12和IFN-γ含量变化情况：从表1中可得，与对照组比较，气滞血瘀组血清中的IL-12含量显著降低（P＜0.01），IFN-γ含量降低，但无统计学差异（P＞0.05）。

表1 血清IL-12和IFN-γ含量变化情况（±s)

表1 血清IL-12和IFN-γ含量变化情况（±s)

注：与对照组比较，▲▲P＜0.01。

IFN-γ(pg/ml)715.88±119.29 704.83±87.06组别对照组气滞血瘀组IL-12(pg/ml)57.81±5.66 40.20±11.72▲▲

4 分析与讨论

本研究发现普氏菌属（Prevotella）、梭菌属（Clostridium XIVa）、毛螺菌属（Lachnospiracea）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）较健康组显著富集；放线菌属（Actinomyces）较健康组显著降低。组间差异性分析血清IL-12和IFN-γ含量变化情况，发现与健康组比较，气滞血瘀组血清中的IL-12含量显著降低（P＜0.01），IFN-γ含量较健康组低，但无统计学差异。

中医基础理论与现代微生态学有着许多共通之处，肠道微生态的平衡与失衡实际上类似于中医学中的正邪理论。从中医学理论来看，气滞血瘀属于邪实，本研究入组的13名患者皆为早期肺癌，一般情况可，体内正气尚能抗邪，处于邪实正不虚的状态。倘若进一步发展成邪实正虚甚至一派虚象之地步，肠道微生态就很可能在其种类、数目、比例等各个方面进一步发生改变，宿主的免疫功能也将进一步产生变化。此外，在属水平上，研究结果提示放线菌属（Actinomyces）较健康组显著降低。放线菌属作为有肠道益生菌，可能直接影响着患者的免疫功能，亦或是其他原因有待证实。本研究组还检测出诸多目前尚未证实的差异菌属，即普氏菌属（Prevotella）、梭菌属（Clostridium XIVa）、毛螺菌属（Lachnospiracea）。为了进一步验证如上猜想，亟待总结并吸取本研究中存在的不足以进行后续更完善的研究。

中医药当前面临着传承不足、创新不够的局面，严重制约着自身发展。中医药发展离不开现代医学的检测手段，迫切需要源源不断地注入创新的“源头活水”，在更多领域取得新突破。当前，免疫组学、蛋白组学、肠道微生态等方面技术为中医药研究突破提供了有力支撑。本文从气滞血瘀型非小细胞肺癌患者肠道菌群与免疫功能的差异入手，并且进一步分析探讨其深层次原因，推测肺癌的形成可能是部分肠道菌群通过调节宿主免疫能力的结果，这是一种行之有效的方法。我们必须秉持“传承不泥古，创新不离宗”的原则，在传承中创新，在创新中传承，推动中医药高质量发展。传承精华，守正创新，必将让中医药获得无限生机。